第一篇：自然辯證法方法論實驗方法和觀察科技總結解讀

一定的世界觀原則在認識過程和實踐過程中的運用表現(xiàn)為方法。方法論則是有關這些方法的理論。沒有和世界觀相脫離、相分裂的孤立 的方法論;也沒有不具備方法論意義的純粹的世界觀。一般說來,有什么樣的世界觀就有什么樣的哲學方法論。唯物主義世界觀要求人們在 認識和實踐中從實際出發(fā), 實事求是。唯心主義世界觀則從某種精神的東西出發(fā)?？陀^唯心主義世界觀要求人們在行動中遵從某種客觀的精 神原則或宗教教義、神靈的啟示等等。主觀唯心主義世界觀則認為人們可以按著自我的感覺經驗、愿望、主觀意志等等行事。辯證法的世界 觀要求從事物的普遍聯(lián)系和永恒運動中把握事物,分析事物自身的矛盾和解決這些矛盾。形而上學世界觀則促使人們孤立地、靜止地、呆板 地考察事物。哲學方法論以一定的世界觀為根據(jù), 世界觀以自身對人們的認識方法和實踐方法的指導意義而取得存在的價值。哲學方法論離 不開世界觀, 自然科學方法論也必須以自然觀和科學觀為前提。各門具體科學的研究方法歸根結柢也受一定世界觀的制約。這種制約以不同 層次的方法論為中介。各層次的方法論不直接同一,它們之間存在著某種差別。世界觀與方法論的一致性不是簡單的同一,懂得世界觀并不 等于掌握方法論。方法論是運用世界觀的理論,但運用世界觀、掌握方法論均需要作專門研究。

中國哲學史上對求知的方法有過許多論述,從不同角度表述了有關認識方法的各種見解,形成了具有中國文化傳統(tǒng)的認識方法的理論, 在人類思想發(fā)展史上有突出貢獻?？鬃訉η笾姆椒ㄓ兴U發(fā)。他強調學思并重,明確提出 “ 學而不思則罔 , 思而不學則殆 ”。這是注重知的 后天來源。他主張 “ 博學 ”、“ 多聞 ”、“ 多見 ”。但反對滿足于獲得眾多雜亂無章的知識,要求用 “ 一以貫之 ” 的原則把所有的知識貫穿起來。“ 一 以貫之 ” 是通過思的功夫達到的,也是思的方法論原則。根據(jù)這一原則,孔子還提出了 “ 舉一隅而以三隅反 ”、“ 叩其兩端而竭 ” 等方法。他還 強調 “ 毋意、毋必、毋固、毋我 ” ,即反對臆測、武斷、固執(zhí)、主觀的思想方法。在孔子以后,墨子注重實際驗證或實際應用的經驗方法。老 子、莊子不重經驗而主張直覺的方法,要求冥思以直接領會宇宙的根本。孟子講盡心,主張反省內求,也是一種直覺 的方法。荀子將觀物與 體道結合起來, 要求在對事物的觀察中認識規(guī)律即 “ 道 ”、并根據(jù)道進行類推, 以求得宇宙萬物的普遍知識。荀子還主張 “ 虛壹而靜 ”、“ 解蔽 ” , 這是他提出的端正思想以求得真知的方法。在中國古代的名辯思潮中,惠施、公孫龍等人的論辯反映了一般與個別、相對與絕對的矛盾,他 們都從不同的側面割裂了個別和一般、相對和絕對的關系。后期墨家和荀子則注意把它們結合起來, 這一討論對推動中國古代思想方法論的 發(fā)展具有重要意義。從宋到明清,哲學家們也比較重視方法論的討論,程朱學派主張 “ 道問學 ” ,注重 “ 格物致知 ” 的綜合方法,認為知為人所 固有,但必須格物以致之, “ 即物而窮其理也 ”。陸王學派則主張 “ 尊德性 ” ,即重內心 , 認為一切真知都來源于內心,只要在內心上下功夫就行 了。清代的王夫之、顏元、戴震都比較重視認識的方法。其中王夫之把前人所講的格物致知分解為二:格物是從事物、經驗中求得道理,即 歸納法;致知是思辨推理的方法 , 即演繹法。而且,他認為兩者是相互補充,不可割裂的 ,“ 非致知則物無所裁,而玩物以喪志;非格物則知非 所用 , 而蕩智以入邪。二者相濟, 則不容不各致焉 ”。中國哲學傳統(tǒng)還特別注重為人們校正行為、提高道德而提供準則和方法。在中國哲學中, 倫理學和道德修養(yǎng)、道德實踐的方法論有著特別豐富的內容,認識的方法論包含在倫理實踐的方法論之中。

古希臘羅馬哲學中,亞里士多德的《工具論》和《形而上學》是有關方法論的重要文獻。亞里士多德發(fā)現(xiàn)的邏輯思維形式和規(guī)律,他所 創(chuàng)立的邏輯體系,到文藝復興以前的許多世紀內,都是西方思維方法的規(guī)范。

在古代中國哲學和古希臘羅馬哲學中, 還沒有專門的自覺的方法論學科分支。方法論的發(fā)展與近代大工業(yè)和自然科學的發(fā)展是不可分的。資本主義的萌芽和工商業(yè)的發(fā)展促使了近代自然科學的興起和發(fā)展, 產生了探索正確認識自然的科學方法論的迫切需要。這時, 哲學作為方 法論的意義才被突出出來。近代方法論的奠基人是英國哲學家 F.培根。他推崇科學,反對遏制科學的宗教神學和經院哲學。培根在《新工具 論》中,總結了科學實驗的經驗,提出了新的認識方法即經驗歸納法。培根用他的方法體系武裝了科學,推動了科學的發(fā)展。

法國哲學家 R.笛卡爾提出了理性演繹方法論。他同培根一樣,反對經院哲學,主張發(fā)展科學。笛卡爾不滿意經院哲學從圣經教義出發(fā) 的演繹法,認為從中得不出任何可靠的知識。他重視理性,在《論方法》一書中提出 4條方法:① 普遍懷疑,把一切可疑的知識都剔出去, 剩下決不能懷疑的東西;② 把復雜的東西化為最簡單的東西,例如把精神實體簡化為思維,把物質實體簡化為廣延;③ 用綜合法從簡單的東 西得出復雜的東西,他說過:“ 給我廣延和運動,就能造出一個世界來 ”;④ 累計越全面、復查越周到越好,以便確信什么都沒有遺漏。他曾 用這種理性演繹法從分析上帝的完滿性的概念推論上帝的存在性。他主張清楚明白性,并稱之為 “ 自然的光明 ” ,即理性。笛卡爾特別強調數(shù) 學,主張一切知識都應該象幾何學那樣,從幾條 “ 不證自明的 ”“ 天賦的 ” 公理中推演出來,認為只有這種知識才是最可靠的知識。

英國的 J.洛克和 D.休謨進一步發(fā)展了經驗主義方法論。洛克提出了感覺論的認識論。休謨提出了批判理性知識的懷疑論。歐洲大陸的 B.斯賓諾莎和 G.W.萊布尼茨進一步發(fā)展了唯理論的方法論。特別是斯賓諾莎用理性演繹法,效法幾何學的方式即公理方法 , 建立了自已的哲 學體系。這時方法論已經作為認識過程的哲學根據(jù)。由于 19世紀以前,整個自然科學還處于搜集材料的階段 , 只有數(shù)學和力學得到較充分的 發(fā)展,故機械論和形而上學思維方法占著統(tǒng)治的地位。

I.康德第一個打破了形而上學思維方法的缺口。他從物質微粒之間的吸引和排斥的矛盾統(tǒng)一運動來說明太陽系的形成和發(fā)展,促使了機 械唯物主義方法的破產。與此同時,他建立了龐大的先驗唯心主義體系,力圖把整個哲學變成方法論?？档屡械乜疾炖硇运季S的方法以及 它認識世界的可能性,形成了先驗唯心主義的批判的方法論?？档屡腥R布尼茨的唯理論,說他盲目地相信理性的可靠性,全盤否認感覺經 驗的必要性;也批判了休謨的經驗論,說他排斥理性在認識中的作用,否定普遍性和必然性,否定了科學知識?？档掳讶R布尼茨的唯理論和 休謨的經驗論結合起來,認為沒有感性直觀材料,理性思維是空洞的;沒有邏輯范疇、概念,感性直觀就是盲目的。但是,在康德看來,邏 輯概念范疇不是來自感性經驗,而是人類認識能力自身固有的,從而實際上否認了邏輯的客觀性。

G.W.F.黑格爾摧毀了康德的批判的方法論。他指明邏輯的客觀性,但把整個世界的歷史發(fā)展看作是絕對理念的辯證的邏輯的發(fā)展。黑格

爾在《邏輯學》中,強調了理念辯證法作為普遍的認識方法和一般精神活動方法的作用,因而他的邏輯學也就是其辯證唯心主義的方法論。黑格爾的客觀唯心主義辯證法,是馬克思以前有關方法論研究的最高成果。

自 19世紀末 20世紀初物理學革命以后,各門科學都有了突飛猛進的發(fā)展。方法論在科學知識中的比重日益提高,方法論對科學發(fā)展 的作用也日益顯著。這是和科學發(fā)展的時代特點密不可分的。具體表現(xiàn)在:① 科學對自然和社會的研究越來越廣泛、深入,使科學研究中直 觀性的程度減少, 抽象化的程度提高, 產生了邏輯思維方法高度發(fā)展的必要性。② 科學的進一步分化和綜合產生了一些新興學科和邊緣學科, 促使科學研究的整體性和綜合性增強,產生了系統(tǒng)理論等具有方法論意義的新學科。③ 現(xiàn)代科學發(fā)現(xiàn)了一系列原有科學理論體系不能解釋和 說明的新的事實, 出現(xiàn)了一些佯謬, 破壞了科學體系原有的原則和思維前后一貫的邏輯嚴密性, 產生了現(xiàn)代科學范疇體系的許多根本性的變 化,同時也促使邏輯方法向前發(fā)展。④ 科學研究課題的復雜性、綜合性在日益加強,隨之而來的科學研究手段日益復雜、精密,科學研究日 益成為集體的、綜合的事業(yè)。由此產生了科學研究課題的各個不同方面、不同層次的相互配合、相互協(xié)調的必要,從而也產生了協(xié)調科學研 究不同方面和不同層次的方法論。

科學發(fā)展的特點給哲學方法論提出了一系列需要解決的問題,例如:觀察和實驗的關系、科學事實和因果性解釋的關系、歸納和演繹的 關系、類推和概括的關系、假說和理論的關系、確定性和不確定性的關系、想象和科學發(fā)現(xiàn)的關系、系統(tǒng)和結構的關系、結構和功能的關系、系統(tǒng)和要素的關系、控制和信息的關系、規(guī)律和預測的關系, 以及理論和實踐的關系等等;科學的發(fā)展對方法論的形式也提出了一系列問題, 例如科學語言的分析、科學理論的形式結構的分析、科學理論的形成發(fā)展和它們的邏輯有效性的條件等等。邏輯經驗主義哲學十分重視對方 法論

形式方面的研究,而且做出了一些有益的貢獻。但是, 邏輯經驗主義哲學否認關于世界觀科學存在的必要性和可能性,把一切關于哲學 世界觀的問題統(tǒng)統(tǒng)斥之為 “ 形而上學 ” 的虛妄問題。邏輯經驗主義者片面夸大方法論的形式方面, 往往局限于對科學理論進行靜態(tài)的邏輯分析, 忽視和貶低經驗的客觀內容,抹殺科學知識發(fā)展中的革命變革問題。自 20世紀 20年代以來,大多數(shù)科學哲學家都把自己的綱領建立在 “ 任 何自然科學的知識內容都具有確定的邏輯結構,可以用一個形式命題系統(tǒng)來表示 ” 這樣一個設想的基礎之上,這種形式化的方法和公理化的 方法, 在科學的發(fā)展中有一定的積極作用, 但是如果忽略有關事物的客觀本質和真實內容, 把對事物的研究僅僅歸結為關系的方法和追溯到 某種設定的公理的方法則是錯誤的。

20世紀 50年代以來,西方科學哲學出現(xiàn)了一個新的發(fā)展趨勢,主要表現(xiàn)在沖破了對科學理論的靜態(tài)的邏輯分析,而把對方法論的研究 同科學發(fā)展的歷史聯(lián)系了起來。如英國的 K.R.波普爾、美國的 T.S.庫恩及以后的拉卡托斯和 P.K.費耶爾阿本德等都試圖從方法論的角度來說 明科學理論的革命和發(fā)展。波普爾把科學的發(fā)展看成是一系列的證偽過程。他強調演繹 , 否定歸納,推崇證偽 , 貶低證實。他甚至說:“ 我們并 不能認識,我們只能猜測。” 庫恩提出科學發(fā)展是通過常規(guī)科學和科學革命的交替發(fā)展來實現(xiàn)的?？茖W革命則是 “ 范式 ”(paradigm的取代。他 認為, “ 新理論如果沒有關于自然界的信念的破壞性的變化是很難興起的 ”。他所說的 “ 破壞性的變化 ” 是一種非理性活動的產物。他否認科學 革命變革中的繼承性。拉卡托斯在吸收波普爾和庫恩思想的長處, 克服波普爾樸素證偽主義的基礎上, 提出只有在科學研究綱領的一定秩序 的提出和實現(xiàn)的基礎上才能發(fā)展科學。費耶爾阿本德則認為,一切方法論都有自己的限度。他通過對科學歷史實例的分析,力圖說明在某種 理論統(tǒng)治下的科學是停滯不前的,并提出了推翻一個既定理論的方法,這就是 “ 什么都行 ” ,即科學家可以自由地嘗試他所喜歡的任何一種程 序。他們都批判邏輯經驗主義把科學發(fā)展看作單純知識積累過程的觀點。但是,他們共同的特點都是片面夸大知識的相對性,而否認知識中 的絕對的客觀內容,從而走向懷疑論。

哲學方法論是適用于一切具體科學的具有普遍意義的方法論?，F(xiàn)代自然科學的發(fā)展不僅發(fā)展了各門具體科學自身的特殊的方法論, 而且 孕育產生了一些只是反

映世界某個側面但帶有普遍意義的科學方法論,如數(shù)學方法。從歷史上看,數(shù)學幾乎同哲學一樣古老,數(shù)學一開始就 具有科學方法論的意義。雖然,數(shù)學最初僅僅在如天象、歷法、土地測量、機械等少數(shù)幾門科學中起著方法論的作用,但是,世界上一切事 物都具有質和量兩個方面,量又規(guī)定著質,質量互變規(guī)律是普遍的辯證規(guī)律。因此,數(shù)學及其方法應該普遍適用于任何一門科學。馬克思認 為,一門科學只有成功地運用數(shù)學時 , 才算達到真正完善的地步。現(xiàn)代科學的發(fā)展日益表明了這一點。數(shù)學方法已日益成為包括自然科學、社會科學、思維科學等一切科學部門不可缺少的方法。但是,數(shù)學方法僅僅涉及事物的量的側面,因此僅靠數(shù)學的方法不能揭示事物的一切 方面,達到對事物的全面的、完整的認識。同時數(shù)學方法的正確運用和數(shù)學方法本身的健康發(fā)展離不開正確的哲學方法論的指導,因而數(shù)學 方法不能取代哲學方法論。

在現(xiàn)代科學的發(fā)展中,除了數(shù)學方法得到普遍運用外,還出現(xiàn)了系統(tǒng)論、控制論(見控制論哲學問題、信息論等橫斷科學。它們對諸多 科學部門都具有方法論的意義。其中, 系統(tǒng)科學的方法論不僅涉及到一般與個別、部分與整體、簡單與復雜、原因與結果等傳統(tǒng)的哲學范疇, 而且還提出象系統(tǒng)、要素、層次、結構、功能等具有哲學意義的新范疇。但是,這些方法論所涉及的都只是世界的某一個側面,它們象數(shù)學 方法一樣都是專門的科學方法論, 不能代替唯物辯證法的唯一科學的哲學方法論的地位。但這些專門科學方法論對唯物辯證法的豐富和發(fā)展 有著積極的意義。

關于認識世界和改造世界的方法的理論。方法論在不同層次上有哲學方法論、一般科學方法論、具體科學方法論之分。科學方法論,包 括培根闡述的實驗方法與歸納邏輯、笛卡兒論述的數(shù)學方法與演繹邏輯, 以及貝塔郎菲的一般系統(tǒng)論方法與中國曾邦哲的系統(tǒng)邏輯 《結構論》。關于認識世界、改造世界、探索實現(xiàn)主觀世界與客觀世界相一致的最一般的方法理論是哲學方法論;研究各門具體學科, 帶有一定普遍意義, 適用于許多有關領域的方法理論是一般科學方法論;研究某一具體學科, 涉及某一具體領域的方法理論是具體科學方法論。三者之間的關系 是互相

依存、互相影響、互相補充的對立統(tǒng)一關系;而哲學方法論在一定意義上說帶有決定性作用,它是各門科學方法論的概括和總結,是 最一般的方法論,對一般科學方法論、具體科學方法論有著指導意義。

馬克思主義哲學是一種科學的哲學方法論,它不僅是認識客觀世界的武器,也是改造現(xiàn)實的武器。我們教科書《馬克思主義哲學原理》 中的哲學內容,并不全是馬克思的首創(chuàng),而大部分是馬克思同意的觀點,比如辯證法理論。馬克思的重要貢獻是歷史唯物主義。

自 19世紀末 20世紀初物理學革命以后,各門科學都有了突飛猛進的發(fā)展。方法論在科學知識中的比重日益提高,方法論對科學發(fā)展 的作用也日益顯著。這是和科學發(fā)展的時代特點密不可分的。具體表現(xiàn)在:① 科學對自然和社會的研究越來越廣泛、深入,使科學研究中直 觀性的程度減少, 抽象化的程度提高, 產生了邏輯思維方法高度發(fā)展的必要性。② 科學的進一步分化和綜合產生了一些新興學科和邊緣學科, 促使科學研究的整體性和綜合性增強,產生了系統(tǒng)理論等具有方法論意義的新學科。③ 現(xiàn)代科學發(fā)現(xiàn)了一系列原有科學理論體系不能解釋和 說明的新的事實, 出現(xiàn)了一些佯謬, 破壞了科學體系原有的原則和思維前后一貫的邏輯嚴密性, 產生了現(xiàn)代科學范疇體系的許多根本性的變 化,同時也促使邏輯方法向前發(fā)展。④ 科學研究課題的復雜性、綜合性在日益加強,隨之而來的科學研究手段日益復雜、精密,科學研究日 益成為集體的、綜合的事業(yè)。由此產生了科學研究課題的各個不同方面、不同層次的相互配合、相互協(xié)調的必要,從而也產生了協(xié)調科學研 究不同方面和不同層次的方法論。

科學發(fā)展的特點給哲學方法論提出了一系列需要解決的問題,例如:觀察和實驗的關系、科學事實和因果性解釋的關系、歸納和演繹的 關系、類推和概括的關系、假說和理論的關系、確定性和不確定性的關系、想象和科學發(fā)現(xiàn)的關系、系統(tǒng)和結構的關系、結構和功能的關系、系統(tǒng)和要素的關系、控制和信息的關系、規(guī)律和預測的關系, 以及理論和實踐的關系等等;科學的發(fā)展對方法論的形式也提

出了一系列問題, 例如科學語言的分析、科學理論的形式結構的分析、科學理論的形成發(fā)展和它們的邏輯有效性的條件等等。邏輯經驗主義哲學十分重視對方 法論形式方面的研究,而且做出了一些有益的貢獻。但是, 邏輯經驗主義哲學否認關于世界觀科學存在的必要性和可能性,把一切關于哲學 世界觀的問題統(tǒng)統(tǒng)斥之為 “ 形而上學 ” 的虛妄問題。邏輯經驗主義者片面夸大方法論的形式方面, 往往局限于對科學理論進行靜態(tài)的邏輯分析, 忽視和貶低經驗的客觀內容,抹殺科學知識發(fā)展中的革命變革問題。自 20世紀 20年代以來,大多數(shù)科學哲學家都把自己的綱領建立在 “ 任 何自然科學的知識內容都具有確定的邏輯結構,可以用一個形式命題系統(tǒng)來表示 ” 這樣一個設想的基礎之上,這種形式化的方法和公理化的 方法, 在科學的發(fā)展中有一定的積極作用, 但是如果忽略有關事物的客觀本質和真實內容, 把對事物的研究僅僅歸結為關系的方法和追溯到 某種設定的公理的方法則是錯誤的。

20世紀 50年代以來,西方科學哲學出現(xiàn)了一個新的發(fā)展趨勢,主要表現(xiàn)在沖破了對科學理論的靜態(tài)的邏輯分析,而把對方法論的研究 同科學發(fā)展的歷史聯(lián)系了起來。如英國的 K.R.波普爾、美國的 T.S.庫恩及以后的拉卡托斯和 P.K.費耶爾阿本德等都試圖從方法論的角度來說 明科學理論的革命和發(fā)展。波普爾把科學的發(fā)展看成是一系列的證偽過程。他強調演繹 , 否定歸納 , 推崇證偽 , 貶低證實。他甚至說:“ 我們并 不能認識,我們只能猜測。” 庫恩提出科學發(fā)展是通過常規(guī)科學和科學革命的交替發(fā)展來實現(xiàn)的?？茖W革命則是 “ 范式 ”(paradigm的取代。他 認為, “ 新理論如果沒有關于自然界的信念的破壞性的變化是很難興起的 ”。他所說的 “ 破壞性的變化 ” 是一種非理性活動的產物。他否認科學 革命變革中的繼承性。拉卡托斯在吸收波普爾和庫恩思想的長處, 克服波普爾樸素證偽主義的基礎上, 提出只有在科學研究綱領的一定秩序 的提出和實現(xiàn)的基礎上才能發(fā)展科學。費耶爾阿本德則認為,一切方法論都有自己的限度。他通過對科學歷史實例的分析,力圖說明在某種 理論統(tǒng)治下的科學是停滯不前的,并提出了推翻一個既定理論的方法,這就是 “ 什么都行 ” ,即科學家可以自由地嘗試他所喜歡的任何一種程 序。他們都批判邏輯經驗主義把科學發(fā)展看作單純知識積累過程的觀點。但是,他們共同的特點都是片面夸大知識的相對性,而否認知識中 的絕對的客觀內容,從而走向懷疑論。

哲學方法論是適用于一切具體科學的具有普遍意義的方法論?，F(xiàn)代自然科學的發(fā)展不僅發(fā)展了各門具體科學自身的特殊的方法論, 而且 孕育產生了一些只是反映世界某個側面但帶有普遍意義的科學方法論,如數(shù)學方法。從歷史上看,數(shù)學幾乎同哲學一樣古老,數(shù)學一開始就 具有科學方法論的意義。雖然,數(shù)學最初僅僅在如天象、歷法、土地測量、機械等少數(shù)幾門科學中起著方法論的作用,但是,世界上一切事 物都具有質和量兩個方面,量又規(guī)定著質,質量互變規(guī)律是普遍的辯證規(guī)律。因此,數(shù)學及其方法應該普遍適用于任何一門科學。馬克思認 為 , 一門科學只有成功地運用數(shù)學時 , 才算達到真正完善的地步?，F(xiàn)代科學的發(fā)展日益表明了這一點。數(shù)學方法已日益成為包括自然科學、社 會科學、思維科學等一切科學部門不可缺少的方法。但是,數(shù)學方法僅僅涉及事物的量的側面,因此僅靠數(shù)學的方法不能揭示事物的一切方 面,達到對事物的全面的、完整的認識。同時數(shù)學方法的正確運用和數(shù)學方法本身的健康發(fā)展離不開正確的哲學方法論的指導,因而數(shù)學方 法不能取代哲學方法論。

在現(xiàn)代科學的發(fā)展中,除了數(shù)學方法得到普遍運用外,還出現(xiàn)了系統(tǒng)論、控制論(見控制論哲學問題、信息論等橫斷科學。它們對諸多 科學部門都具有方法論的意義。其中, 系統(tǒng)科學的方法論不僅涉及到一般與個別、部分與整體、簡單與復雜、原因與結果等傳統(tǒng)的哲學范疇, 而且還提出象系統(tǒng)、要素、層次、結構、功能等具有哲學意義的新范疇。但是,這些方法論所涉及的都只是世界的某一個側面,它們象數(shù)學 方法一樣都是專門的科學方法論, 不能代替唯物辯證法的唯一科學的哲學方法論的地位。但這些專門科學方法論對唯物辯證法的豐富和發(fā)展 有著積極的意義。

自然辯證法對于我們進行科研工作的指導意義是毫無疑問的。

我們在進行科學研究工作時,在其過程中總會形成自己的世界觀,這個世界觀提供的方法論反過來會影響和指導我們的工作和學習,或許 是有意識的,或許是無意識的。而自然辯證法就為完善和拓展我們的世界觀起到一個很好的推動作用。通過對

自然辯證法的學習,我們可以 開闊自己思路和視野, 學會從更高的層面和更廣的范圍來思考問題, 所以自然辯證法在一定意義上可以指導和幫助我們進行科學研究。下面, 我就自然科學方法論的具體內容,談一談自然辯證法對科學研究指導和幫助作用。

科學研究必須從實際出發(fā),但是科學理論并不是自發(fā)產生的,必須經過從實踐到感性認識,再到理性認識,最后上升到理論的過程,是 認識上的一次質的飛躍。從實踐到感性認識的過程,也就是科學實驗的過程,我們需要利用實驗這種形式和方法來觀察和記錄實驗現(xiàn)象。待 實驗材料累積到一定程度, 我們便形成了對于實驗對象以及實驗本身的感性認識。只達到感性認識通常是不夠的, 因為科學的理論不是一下 就能達到和完成的,在得到感性認識的基礎上,我們會提出一系列的假設或假說,反過來實驗基礎上進一步發(fā)展這些假說并檢驗這些假說。在科學實驗上不斷檢驗為正確的假說, 在經過科學家的不斷抽象和概括, 就可以逐漸過渡成為科學的理論。以上是我們進行科學研究的大致 過程,其中的過程是很復雜的,但是基本都要經過:實驗、抽象、假說這幾種過程和方法。

科學實驗在科學研究中起著重要作用, 它是社會實踐的一種形式。古代科學實際上幾乎是完全沒有實驗研究的, 而大多是一些原始觀察 和經驗描述, 像阿基米德發(fā)現(xiàn)浮力定律, 也是依靠及其簡單的設備在偶然條件下實現(xiàn)的?，F(xiàn)代科學實驗是在科學技術達到到一定水平時才發(fā) 展起來的。較之于直接觀察和經驗描述, 科學實驗有很多優(yōu)越性, 它可以通過對實驗材料的進一步加工, 把事物的內在聯(lián)系進一步揭發(fā)出來。可能某些人會有疑問,我們目前的很多科學實驗,大多是在一些簡單和極端條件下進行的,難免有脫離實際的問題,其實有想法有其一定道 理,但是未免太具有局限性。人在認識事物時,總是從局部到全面,由簡單到復雜的一個過程,如果一開始不把局部和簡單事物了解清楚, 那對于整體和復雜事物的了解將更加困難。當然,如果認為簡單事物的機械疊加就是復雜,局部事物的簡單集合就是整體也是不對的,那就 陷入了形而上學。實際上科學實驗是分析研究的一個必須要階段,沒有這種過程,就不可能在更高層次上有正確的綜合。總之,科學實驗在 科學研究中起著非常重要的作用,脫離科學實驗而空想理論,難免陷入唯心主義的泥潭。

科學研究中的抽象就是把復雜的條件暫時簡化,暫時撇開那些次要因素,是一種非常重要的研究方法。比如我們在設計程序和電路時, 往往會先設定一個簡單的環(huán)境, 來驗證我們的設計是否合理和工作正常, 在工作正常條件下, 我們再進一步考慮在一些復雜條件下出現(xiàn)的問 題,在反復實驗并解決各種問題后,就最終得到一個可以經得起考驗的成熟設計。而在實際科研工作中,我們不僅回來實驗室內簡化實際條 件,還經常運用思維能力,暫時撇開次要因素,來抽象地進行研究。特別是科學上的一些概念和理論,但從實驗角度很難進行直觀的表達, 所以就常常需要對一些抽象的理想形態(tài)進行研究。

在抽象過程的某一階段,科學理論的發(fā)展又常常表現(xiàn)為假說的形式。在這個階段中,認識以及具備了理論的雛形,但是還不夠成熟。恩格斯曾經說過:“只要自然科學在思維著,它的發(fā)展形式就是假說?！边@說明假說是科學研究中不可缺少的階段。使用假說的方法,并不是 進行毫無根據(jù)的猜想, 而是必須基于一些事實和現(xiàn)象為依據(jù), 或者它本身就是一個正確原理的推廣, 它不能和已知為正確的事實或者已經由 實踐證明為正確的理論相沖突。而由于人們對于事物的認識不全面,可能出現(xiàn)很多中假說并存的局面,比如關于生命的起源,就有多重假設 存在。很多情況下,只有其中某一種假說是正確的,但是更多情況下,這些假說是相互印證,相互補充,這種情況,對于科學研究的發(fā)展是 大有裨益的,通過不斷的爭論和討論,我們最終可能得到正確的結論。假說的形成與我們的世界觀是相聯(lián)系的,正確的假說往往是在一定程 度上運用的自然辯證法的方法論而獲得的結果,而如果缺乏科學的態(tài)度,從錯誤的世界觀和方法論出發(fā),得到的假說往往的錯誤的,不但不 能對于科學研究起到推動作用,反而會誤導我們。

哲學,當人們用它去說明世界的時候,是世界觀;當人們用它去指導認識和改造世界的活動時,就成了方法論。馬克思主義哲學作為科 學的世界觀和方法論,尤其是其中的自然辯證法,它與自然科學研究活動的關系特別密切,也特別值得我們認真去對待。

自然科學與哲學的分化,使哲學成為專門研究自然、社會和人類思維一般規(guī)律的學問,但哲學并不因此而失去與自然科學的聯(lián)系。推動 哲學前進的,并不單純是哲學家們的頭腦,而是日益發(fā)展的科學和技術的力量。近代自然科學為哲學的概括提供了大量的實證知識。

筆者認為,遇到新課題正是自然辯證法研究價值之所在。數(shù)學大師希爾伯特就曾經說過:“只要一門科學分支能提出大量的問題,它就 充滿著生命力。”正因為自然辯證法的物質觀、時空觀等方面面臨著現(xiàn)代自然科學研究中出現(xiàn)的若干新問題,它才顯示出強大的生命力。筆 者深信,隨著科學技術的進步,自然科學研究的突破性進展,自然辯證法對提出的新問題會作出令人滿意的哲學概括,從而也促進自然辯證 法本身向前發(fā)展。大量科學史實表明:自然辯證法必須植根于自然科學研究這片沃土。首先,它的每一個哲學概括都來源于自然科學研 究的實踐,并回到自然科學研究的實踐中去經受檢驗。雖然哲學家的思辯是重要的,但自然科學的進展是自然辯證法的一個重要生長點,這 是不容置疑的。自然辯證法研究者必須經常地從自然科學研究的最新成就中吸收營養(yǎng),不斷豐富和發(fā)展它的各種基本原理。實際上,任何哲 學,只有當它的每一個細節(jié)都能夠經受得住自然科學研究的嚴峻考驗,它才是有力量的,辯證唯物主義哲學也不例外。在任何時候,自然辯 證法都必須隨著自然科學研究的進展更新和豐富自己的內容。

二、自然科學的發(fā)展離不開自然辯證法的指導

自然科學與哲學的分化, 使自然科學研究高度集中于考察某一個相對狹窄的專業(yè)領域, 但并不取消它與哲學的聯(lián)系。因為自然科學中的 許多新的發(fā)現(xiàn)和新的理論要求從總體上和本質上給予解釋, 而且科學研究的方法更離不開哲學的幫助。一般說來, 人們對自然界各種對 象的研究基本上要通過精密的觀察和測量, 并運用理論思維進行分析概括而得出結論的。它既要求有堅實可靠的實驗基礎, 又并不停留在對 實驗結果的描述和經驗規(guī)律的概括上,而是力求發(fā)現(xiàn)物質結構和運動的內在聯(lián)系及其定量關系,形成新的概念,概括出普遍規(guī)律,建立起嚴 密的理論邏輯體系。人們在探索自然界的客觀規(guī)律和建立系統(tǒng)的科學理論的道路上, 不可避免地要運用人類長期社會實踐中所獲得的認識事 物的經驗,要使用一些概念、范疇,運用一些方法,經

歷認識發(fā)展的一定過程,這就自覺不自覺地把哲學思想引進自然科學的研究工作中。正如恩格斯所說:“不管自然科學家采取什么樣的態(tài)度,他們還是得受哲學的支配。問題在于:他們是愿意受某種壞的時髦哲學的支配還是 愿意受一種建立在通曉思維的歷史和成就的基礎上的理論思維的支配?！?/p>

可以說,作為方法論,自然辯證法的指導作用貫穿于我們從事科研活動的全過程。首先在如何選擇科研課題、確定研究方向的問題上, 發(fā)現(xiàn)問題、提出問題、確定主攻目標等等,都是一系列復雜的思維過程。有自然辯證法作指導,就容易從平常的事物或現(xiàn)象中,發(fā)現(xiàn)不平常 的情況,從而發(fā)現(xiàn)和提出問題;就能夠以一定的科學事實和經驗材料為依據(jù),以一定的科學理論為指導,去唯物地、辯證地分析未知的自然 事物, 從而確定出能有創(chuàng)見、能出成果的研究方向和課題。在設計實驗、分析實驗結果的問題上, 除了動手去做, 還需要思維, 有計劃、分步驟、有目的地把實驗完成。有自然辯證法思想的指導,就可以注意到繼承和創(chuàng)新的辯證關系、注意到區(qū)分主要矛盾和次要矛盾,設計出 切實可行的實驗來;就可以注意到自然事物都是質和量的對立統(tǒng)一,求出某些因素之間量的關系,分析出質量互變的外因與內因,從而對實 驗結果作出正確的判斷。在提出新假設、建立新理論的問題上,有自然辯證法思想作指導,就可以排除各種毫無事實根據(jù)的主觀臆斷和 迷信, 把假說建立在一定實驗事實和經驗材料的基礎上;就可以勇于讓假說回到實踐中去驗證, 使之在反復實踐驗證中得以完善而上升為理 論;就可以使建立起來的理論做到客觀、全面、系統(tǒng)和邏輯嚴密;就可以正確認識各種科學理論的內在聯(lián)系和真理相對性的辯證關系,從而 把科學研究引向深入。從發(fā)展的眼光看,現(xiàn)代自然科學的進步,出現(xiàn)了既高度分化又高度綜合的趨勢。原有的一門學科向縱深發(fā)展,演 變出許多分支學科;而各門學科的彼此滲透、互相影響,在邊緣交叉地帶、在橫斷面上、在各種知識的融匯貫通中形成了更高層次的新興綜 合性學科。這就使自然科學與哲學出現(xiàn)了聯(lián)系更加緊密的整體化趨勢。

一、科學事實

1、定義:科學事實是指人們對所觀察到的客觀存在的事件、現(xiàn)象和過程所作出的真實描述。

2、事實的三個層次

客觀事實——是指客觀存在?？陀^事實的特點是:客觀性、無限性,無對錯真假之分。

經驗事實——是指納入人類認識范疇的客觀事實。其特點是滲入主觀經驗,有對錯真假之分,而且具有個體差異。

科學事實——是指納入科學認識的客觀事實。其特點是:客觀性、可檢驗性、系統(tǒng)性,存在著對錯真假的問題。

3、經驗事實與理論事實:理論事實是指按照某種理論推理得出的關于某種客觀存在、關系、規(guī)律的斷定。如黑洞、兩點之間直線最短等。理論事實可以轉變?yōu)榻涷炇聦?也可能只能用理性把握。

4、兩種錯誤觀點:唯心主義經驗論:不承認客觀事實的真實性。機械唯物論:認識類似于照相機、復印機

5、科學事實的特點:客觀性;可重復性:他人能夠重現(xiàn);個別性:單稱而非全稱;獨立性:理論變,事實不變

1、定義:觀察方法是指在理論的指導下,通過感覺器官或儀器,有目的、有計劃、有選擇地感知和描述研究對象,獲取科學事實的方法。理解要點:目的明確;系統(tǒng)全面;有理論指導;感性層面;自然條件下

2、特點:目的性與計劃性;自然性:傷寒的四個周期;結果的可重復性、精確性

3、觀察方法分類:

直接觀察與間接觀察——直接觀察:感覺器官,方便但有限,易出錯。間接觀察:儀器設備,擴展范圍與深度,結果精確,可持續(xù)進行。質的觀察與量的觀測——質的觀察:對事物現(xiàn)象定性。量的觀測:對事物、現(xiàn)象定量,非常重要。

4、觀察方法的作用:創(chuàng)立理論和假說的基礎;檢驗假說和理論的標準

5、觀察的基本原則: 客觀性原則——客觀性是要求按照客觀事物的本來面目描述事實現(xiàn)象。其反面是主觀性,包括主觀選擇與期望。

全面性原則——全方位、多角度、多層次地觀察認識對象。意義有三:一是避免片面性,二是系統(tǒng)觀察,三是注意觀察的條件性。

1、含義:根據(jù)研究目的,利用儀器設備,人為干預、控制或模擬研究對象,獲取科學事實的一種研究方法。實驗方法是思維能動性與技術 手段的有機結合。

2、實驗方法的分類: 定性實驗與定量實驗——定性實驗是確定事物的有無,定量實驗的確定事物的數(shù)量。

直接實驗和間接實驗——直接實驗是指直接對研究對象進行實驗。間接實驗是模擬實驗,是通過研究模型來認識原型。

模擬實驗——因原型重要或巨大,不適宜直接實驗,如人體、三峽大壩。模擬實驗包括物理擬兩種。

析因實驗——模擬和數(shù)學模尋找某種既定結果發(fā)生的原因,如瘧疾的傳染源。因果聯(lián)系的多樣性與復雜性。

結構分析實驗——測定和分析研究對象的結構,如人際關系。

對照實驗——對照實驗是設立兩個及以上對照組,比較分析多因素與結果之間的關系。如個體差異、心理因素的影響等。

3、實驗方法的特點: 實驗方法是主觀能動性的體現(xiàn) ——實驗是在思維中將客觀事物的性質、結構、關系抽象出來的能動過程。如巴斯德在與普歇就 “生命自然發(fā) 生問題”爭論的系列實驗。

揭示事物的內在性質、結構、過程和關系——阿基米德對金冠的實驗,外科醫(yī)生亨特關于梅毒與淋病的實驗。

實驗方法精確、經濟、快捷;實驗方法可簡化純化自然;實驗方法可重復自然現(xiàn)象 ——自然現(xiàn)象往往是一過性的,實驗則能夠留住自然的腳步。

實驗方法可強化自然現(xiàn)象。

4、實驗方法的作用:實驗方法是提出新思想,檢驗新假說的重要方式。

1、中性觀察假設:觀察結果是主觀對客觀的忠實反映,堅持簡單的正確與錯誤劃分標準。不同的人在同一條件下觀察同一對象,其主觀反 映一致。要求科技工作者在觀察活動中保持純粹的客觀性。

2、觀察的心理特點:觀察是知覺過程,知覺存在著錯覺,還具有選擇性、組織性、整體性等特點,決定了中性觀察的不可能。

3、影響觀察的因素

知識和經驗的影響:對同一對象,看到的信息與知識和經驗成正比。如語言學家分析出 are 和 were 的區(qū)別。

心理定勢:原發(fā)性癌與繼發(fā)性癌

語言和假說的引導:“要不要雞蛋”與“要一個雞蛋還是兩個雞蛋”。夢的研究中不同的提問方式:“你剛才在做什么夢?”與“你能想起醒 來之前發(fā)生什么事情嗎?”

觀察維度:二維還是三維

3、結論及其意義: 觀察受理論的影響——純粹的中性觀察不存在,觀察活動及其結果受理論的影響。

堅持能動的反映論——認識過程是人的創(chuàng)造過程,不能將認識理解為機械反映過程。

創(chuàng)造性思維方式的培養(yǎng)——在集合思維與發(fā)散思維之間保持平衡,注重培養(yǎng)發(fā)散性等具有創(chuàng)造性的思維方式。

科技工作者開放的態(tài)度——由于科學事實與客觀事實存在著區(qū)別, 有可能出現(xiàn)科學事實多樣性的結果, 對此應該持開放的態(tài)度?；谕皇?實有可能得出不同的假說。

4、觀察結果客觀性問題:與藝術等表達情感需要的人類活動不同,科學事實具有同一性。科學家通過實驗或邏輯檢驗實現(xiàn)消除差別的目的, 最終達到一致。

一、技術的定義:人類通過運用自然規(guī)律創(chuàng)造的滿足需要的物質手段、工藝方法及掌握這些手段和方法的技能體系。

理解要點:

1、技術目的

2、人的能力

3、人的經驗、知識 :軟件

4、物質手段 :硬件

關于硬件:社會發(fā)展程度的標志;社會發(fā)展的推動力量

關于軟件:設計、制造知識;使用知識與方法;接收、理解與解釋;人們往往重視硬件,不重視軟件。

二、技術的特性

1、社會性——技術反映社會發(fā)展程度;技術反映社會需要方向

2、選擇性——同一目的,可以采用不同技術手段滿足。選擇的道德原則問題。

3、創(chuàng)造性——技術是人類能動性的表現(xiàn)。

4、容許性——技術應用時允許一定的誤差范圍。醫(yī)療事故的不可避免性(知識欠缺、能力欠缺、不可避免的錯誤。技術的可改進性。

5、直接的經濟效益——技術的使用帶來直接的經濟效益,因而技術可以進入技術市場進行交易。

6、保密性——技術秘密不可輕易泄露。

三、技術與科學的聯(lián)系和區(qū)別

1、聯(lián)系——科學與技術獨立發(fā)展階段;技術進步依賴科學進步;科學技術化與技術科學化

2、區(qū)別: 目的不同——科學是發(fā)現(xiàn)自然的秘密;技術是控制自然的手段

形態(tài)不同——科學研究的最終產品是知識;技術研究的最終產品是儀器設備等物質形態(tài)。

選題方式不同——科學的選題由問題決定,多為自由探索方式;技術選題由社會的直接需要決定。

研究期限不同——科學研究目標不明,條件不明,期限不確定;技術研究目標明確,期限相對確定。

經濟效益不同——科學研究的效益呈現(xiàn)長期的特點,具體效益不確定;技術的效益明確,可直接計算。

評價標準不同——科學的評價標準是邏輯與事實;技術的評價標準是有效性、先進性。

研究動力不同——科學研究追求理解自然奧秘和了解之后的名譽;技術發(fā)明追求經濟效益和利益。

四、技術進步的方式

1、技術發(fā)明:是尋找到新的技術,如抗生素、輸血技術等發(fā)明。發(fā)明具有創(chuàng)造性、新穎性、可行性等特點。

技術發(fā)明的類型——由科學事實導致的發(fā)明,如 X 光技術;由理論導致的發(fā)明,如免疫技術;由經驗導致的發(fā)明,如青蒿素。

2、技術革命:由一系列技術發(fā)明引起的某個領域中技術的革命性變化。現(xiàn)代醫(yī)學的技術革命——外科技術革命;內科激素類藥物導致的革命;抗生素應用導致的治療感染性疾病的技術革命;成像技術導致的診斷學 的技術革命;遺傳工程技術革命。

3、技術革新:技術原理不變,但進行改進,追求更好的效果。如半合成青霉素。

4、技術綜合:將實現(xiàn)同一目的的多種技術進行重組,形成合力。

5、技術轉移:將其它領域的技術轉移到新的領域,包括硬件、軟件、人才三個方面。

科學事實在科學認識的作用;觀察方法;實驗法

什么是科學事實---在科學認識中,人們通常在兩種不同的含義上使用“事實”這一概念 “事實 1”或稱為“客觀事實” :

第一種是指在時間和空間中客觀存在的,被觀察到的事件、現(xiàn)象和過程。它指的是客觀事件、現(xiàn)象和過程本身 ,是本體論意義上的事實?！笆聦?2”或稱為經驗事實: 第二種是指用某種語言描述被觀察到的客觀事件, 現(xiàn)象和過程所得出的經驗陳述或觀察判斷, 是通過經驗的、實踐的途徑確立了的真實判 斷。這種事實是一種知識形態(tài)的事實,即關于事物的比較直接的,比較確實的知識。

事實 1與事實 2的區(qū)別---“事實 1”是在觀察和實驗中被觀察到的,但又不依賴于觀察者而存在的客觀事件,是第一性的?！笆聦?2”則是觀 察者對“客觀事實”的觀察描述,是對記錄到的“事實 1”所作的陳述和判斷。

科學事實指的是事實2而不是事1。事實1在科學歸納過程中無法直接使用。只有轉化為事實2才能被科學認識所利用。所以,科學事實是 指事實2意義上的事實。但是,并不是一切觀察陳述都是科學事實,只有為經驗或實踐所檢驗過的,正確反映客觀事實的觀察陳述,即真實 判斷,其內容才具有客觀性,才稱得上科學事實。由于人的認識過程的復雜性,在觀察陳述中不可避免地要受到各種主觀因素的“污染” , 從而帶來易謬性,在經驗事實中摻雜著虛假的事實描述。因此,在科學研究中,不僅要把“事實1”和“事實2” ,即客觀事實和經驗事實 相區(qū)別, 而且要將經驗事實中反復多次被經驗確定了的真實事實與未經檢驗的 “事實” 相區(qū)別, 要隨時注意從觀察陳述中清除主觀因素的

“污 染” ,從中把握住不依賴于認識主體的客觀內容,如此方能確立真正的科學事實。

下幾個基本特征:

其一,它描述的對象是獨立于人的意識之外而客觀存在的事件、現(xiàn)象、過程;其二,它描述的是已經成為人們科學探索的對象,被人們在科學觀察和實驗中觀察到了的那些客觀事件、現(xiàn)象和過程;其三,它是由經驗檢驗過的人們對客觀事件、現(xiàn)象和過程的正確反映。那些不正確地反映客觀事件、現(xiàn)象和過程的描述則不能稱之和“科學 事實”。

“不管鳥翼是多么完美,但如果不憑借空氣,它是永遠不會飛翔高空的。事實就是科學家的空氣。你們如果不憑借事實,就永遠也不能飛騰 起來?！痹诳茖W研究中,科學事實是進行科學抽象和開拓新研究領域的實踐基礎,是形成檢驗科學假說和科學理論評價的主要依據(jù);是補充 和發(fā)展科學理論的重要途徑

科學觀察可以分為自然觀察和實驗觀察。自然觀察通常被人們簡稱作“觀察”

變革和控制的情況下進行的。這一點是觀察方法和實驗方法的主要區(qū)別。因為,在實驗中也必須運用觀察方法,但從科學方法來說,它已經 包容在實驗方法之內, 并非單純的觀察方法了。觀察方法雖然不具有實驗方法那種變革和控制研究對象的優(yōu)點, 但由此卻使它具有比實驗方 法更為廣泛的研究領域。除了在實驗中必須運用觀察方法之外, 在那些還不可能或不宜運用實驗方法來變革和控制研究對象的領域, 觀察方

方法,如天文學觀察;第二,當研究課題的性質不允許對研究對象加以干擾或變革時,如臨床觀察,物候學研究等也必須采用觀察方法;第 三,以直接記錄或描述自然事物或現(xiàn)象為基本前提,或仍處于描述階段的那些新興科學,觀察方法仍然是主要的研究方法,如動、植物形態(tài) 是它的目的性和計劃性。觀察并不是憑借人的 感官盲目地看。觀察作為自然科學研究所運用的一種基本方法,它是積極能動的。人們正是根據(jù)所要解決的課題,制定觀察的計劃,確定觀 察的對象,觀察的角度,觀察的方法、步驟,等等。這一特點,使之區(qū)別于一般感性認識活動。

也就是說, 自然科學的研究對象, 可以被人們的感官直接感知到或者借助觀察儀器最終被感官間接感知到。這一原理承認觀察對象是不依賴 于觀察主體而獨立存在的客觀實在, 同進又承認這些客觀對象能夠同觀察儀器和觀察者發(fā)生相互作用, 因而客觀對象的信息可以直接或間接 地被觀察者所反映,所把握。堅持可觀察性原則的意義:第一,這條原理意味著科學技術研究必須將那些不具有客觀實在性的,不和其他物 體發(fā)生作用的, 因而也不能傳遞任何住處的各種臆想客體(如神靈、上帝之類 堅決排除在外, 科學觀察只能在原則上可觀察的領域內進行。第二,可觀察性原則要求構思和設計觀察儀器,以及選擇觀察場合和條件,必須充分注意觀察手段和觀察對象的能見度,即能夠把對象的信 息顯露出來。這對于微觀和宇觀客體尤為重要。觀察手段和條件應當在最大限度內使微觀象和宇觀現(xiàn)象達到宏觀范圍內被感官所接受。第三, 這條原則還要求觀察者辯證地把握觀察對象同手段和觀察者本身之間的相互作用,這種相互作用本身具有客觀性,既不是主觀隨意加上的, 也不是隨意可去掉的,而在于如何正確地把握這種相互影響的客觀性。這一點和后面專門講到的觀察的客觀性原則是一致的。第四,可觀察 性原則對于假說的觀察檢驗具有重大價值, 它實質上同后面講的假說的可檢驗性問題是一致的。即假說推演出來的關于事實的結論, 應當是

原則上可以通過觀察到的科學事實加以檢驗的,否則假說是不可取的。當然,這和技術上的可觀察性密切相關,在理論層次上假說的可檢驗 性,歸根到底取決于經驗層次上的可觀察性。

根本目的在于獲取對象的事實材料,因此為了提高觀察效率和保證觀察材料可靠,必須堅持觀察的客觀性這一根本原則。

第一 要以正確理論為指導,避免主觀偏見。

作為有目的的科學觀察總是以某種科學理論為背景, 因此觀察中必然滲透著理論因素, 美國科學科學哲學家漢森于是 1958年明確提出了 “觀 察滲透理論”的重要命題。他指出:“由于各人具有不同的經驗,認識和理論,具有不同的背景和知識,所以不同的人可能從同一對象中觀 察到不同的東西;進行觀察陳述必須運用某種語言,作出具有某種理性結構的判斷。這樣,就會導致兩種可能:以正確反映客觀事物本質的 理論來指導觀察,將保證觀察的客觀性;相反,當不完備的甚至錯誤的理論和觀點滲透到觀察之中,就會導致觀察的主觀性和易謬性?！?在觀察中,導致觀察主觀性的因素有先入之見,無意過失,假象和錯覺等。先入之見主要由假說的錯誤或過分相信自己的假說所造成。(舉 例:荊人失斧如果假說是錯誤的,觀察者把它作為“有色眼鏡” ,只觀察到某些似乎能證明自己假說的現(xiàn)象,對大量同假說不符合的現(xiàn)象 則視而不見,或者用假說去歪曲觀察結果等,都會陷入觀察的主觀性。無意過失主要指觀察者在觀察過程中無意識地滲入了某種主觀因素, 使觀察者用自己過去的經驗、知識,去填補觀察中的空白,從而作出錯誤的觀察陳述。

假象也是事物本質所表現(xiàn)出來的一種現(xiàn)象, 但卻給人一種同事實真相不同的錯誤感覺。假象往往和人們觀察事物的直觀角度有關。當人們站 在地球上觀察太陽運行的現(xiàn)象時,看致電太陽每天東升西落,似乎太陽在圍繞地球運行, 這就是一種直觀的假象。錯覺的產生則和人的感官 和心理因素有關。當一個人把左手放進熱水而把右手放進冷水中浸泡一段時間,然后把兩手同時放進溫水中,這時,左手感覺到水是

冷的, 而右手感到水是熱的。這是由感官的溫差而引起的錯覺。導致觀察主觀性的因素是多方面的,必須隨時注意防止和克服。堅持實事求是的科 學態(tài)度,采取重復觀察和在各種不同的條件下觀察等,對于防止和克服觀察的主觀性,達到觀察的客觀性,都是很重要的。

第二 要進行系統(tǒng)的全面的動態(tài)的觀察,防止片面性。

列寧在談到辯證法要素時著重指出:“應當從事物的關系和它的發(fā)展去觀察事物本身。” 這就是說應當從事物的空間分布上, 觀察事物的各個 方面,事物的全體;從事物本身的關系以及一事物與它事物的相互聯(lián)系上,觀察事物的整體特征和事物在環(huán)境中或更大系統(tǒng)中的表現(xiàn);從事 物的演化上,系統(tǒng)觀察事物變化發(fā)展的各個階段和事物發(fā)展的全過程,等等。

第三 要注意選擇典型的觀察對象和觀察條件,避免次要因素的干擾。由于客觀事物常常相當復雜,其過程往往不那么純粹和單一,本質很容易為紛繁的現(xiàn)象所掩蓋。要使觀察材料反映事物的客觀本質,就必須 暫時撇開與當前觀察無關的內容, 撇開次要的過程和干擾因素, 使事物的自然狀態(tài)即具體復雜的表象形態(tài)變成比較純粹的形態(tài), 讓其主要過 程充分暴露出來。為此就必須選擇典型的觀察對象,并且選擇那些干擾比較小的環(huán)境去進行觀察。例如,伽利略最早提出了測量光速但卻未 能解決它。在當時的條件下,對地面上光源發(fā)射的光進行觀測來決定光速是不可能的。1676年丹麥天文學家雷默采用天文觀察的方法,選 擇木星衛(wèi)星的星蝕作為觀察對象, 在地球運行到太陽與木星之間時和在地球再運行到太陽另一邊時, 分別測星蝕出現(xiàn)的周期, 發(fā)現(xiàn)后者要比 前者長一千多秒,由此推算出光速為每秒 225000公里。雖然精確度很差,但卻第一次通過觀測的方法肯定了光速是有限的。雷默的初步成 功可以說是與他選擇典型的觀測對象和觀測條件密切相關的。

緒 論

一、兩個名稱的并存

“ 自然辯證法 ” 一名來自于恩格斯書稿《自然 辯證法》(1873-1886 ,主要講三個方面的辯 證法:自然界的辯證法、自然科學的辯證法和 自然科學研究的辯證法。

“ 科學技術哲學 ” 一名與 20世紀 80年代西方 科學哲學開始傳入我國有關, 西方科學哲學把 科學作為哲學的研究對象, 著重探討科學的劃 界、科學發(fā)現(xiàn)的邏輯、科學發(fā)展的模式等問題, 原則上不談論自然界和各門自然科學理論中 的哲理。

為便于國際學術交流,有學者主張用 “ 科學技 術哲學 ” 來取代 “ 自然辯證法 ” 來作為該學科的 名稱。

《自然辯證法》 與西方科學哲學都不探討技術 問題, 但由于技術在現(xiàn)代社會的重要性以及技 術與科學的密切聯(lián)系, 對技術的哲學思考也被 納入該學科領域。

目前, 國務院學位委員會的學科目錄中, 采用 了 “ 科學技術哲學 ” ,而研究團體、學術刊物、課程名稱仍叫 “ 自然辯證法 ”。

兩種名稱并存反映了在這個學科領域存在著 兩種傳統(tǒng):把該學科看作是馬克思主義哲學的 分支, 強調用馬克思主義哲學的觀點、方法來 研究這個學科;在歐美科學哲學的背景下來理 解這個學科, 強調是哲學的一部分, 強調國際 學術交流,強調語境的統(tǒng)一。

二、什么是自然辯證法

自然辯證法(亦稱 “ 科學技術哲學 ” 自然辯證 法是馬克思主義哲學體系中的一個重要的分 支學科,它以人與自然的關系為中心線索 , 研 究自然界的辨證本性、認識和變革自然的辨證 過程以及科學技術與社會的辨證關系.三、自然辯證法的學科性質

中介性:自然辯證法是溝通馬克思主義哲學與 各門具體科學的橋梁 哲學的分支:自然辯證法從學科本性上屬于哲 學。

四、自然辯證法的主要研究對象 辯證法

辯證法(dialectics 源出希臘語 “dialego” ,意 為談話、論戰(zhàn)的技藝, 指一種邏輯論證的形式。不同時期的哲學家對辯證法有不同的認識, 馬 克思主義認為, 辯證法是關于普遍聯(lián)系發(fā)展的 學說。

主線:人與自然關系

五、自然辯證法主要內容

辨證自然觀:自然界的存在方式、自然界的演 化發(fā)展規(guī)律、人和自然界的關系 科學觀與科學方法論:科學的本質與價值、科 學研究中的一般方法

六、學習自然辯證法的意義

1、啟發(fā)科研思維,提高科研能力 哲學為什么能啟發(fā)科學? 哲學因具有懷疑、批判和叛逆的精神, 所以能 夠成為新科學之母。哲學是科學的先導、“ 偵察兵 ”

2、提高研究人員的科學素養(yǎng)與人文素養(yǎng)

七、學習自然辯證法的方法 堅持理論聯(lián)系實際 重視原典和經典 注重相關學科的知識 第一章 科學觀

一、科學劃界的含義

1、含義 所謂科學劃界就是尋求科學與其它知識的 區(qū)別及其標準, 回答?°什么是科學?±這一 問題的科學哲學領域?？茖W劃界問題是科學 哲學的基本問題。

思考與討論:科學的本性是什么?

2、歷史上的主流觀點及困難

從亞里士多德到 18世紀末的哲學家、科學 家都把科學知識的確實可靠性作為科學區(qū) 別于非科學與偽科學的本質屬性。19世紀隨著認識論中可錯論觀點的出現(xiàn)和 勝利, 科學的確實可靠性標準便弱化為科學 方法的確實可靠性標準, 但稍后便被證明同 樣是站不住腳。

二、科學劃界的基本標準

1、可檢驗性標準

必須包含有關于自然界的信息, 從而能夠被 觀察和實驗證據(jù)所檢驗。必須能夠經受住檢驗。

3、超量內容標準

必須比舊理論包含更多的信息, 具有更強的 解釋力

4、邏輯性標準

概念必須清晰,邏輯必須自洽

5、相容性標準

必須能夠與當下主流的科學觀點相容, 進而 能夠為科學共同體所接受。

以上第1、5標準在用來判定一個理論是否 是科學時都不能被絕對化, 因為觀察與實驗 滲透理論, 并非完全客觀;而過于強調相容 性標準, 又有可能壓制重大科學創(chuàng)新, 阻礙 科學發(fā)展。

三、科學劃界的意義

關于科學劃界的努力是一項無止境的事業(yè)。雖然科學哲學至今仍無法給出一個清晰、一 致、可操作的標準, 但科學的基本形象是清 楚的, 作為科學劃界標準的必要條件也是明 確的。

科學劃界是一項有意義的工作, 有利于明確 科學的知識特性, 更有效地揭露偽科學甚至 反科學,維護科學的尊嚴和社會形象。第二章 技術觀

一、技術的含義 ? 定義

– 技術是人類為了滿足社會需要依靠自然 規(guī)律而創(chuàng)造的各種調節(jié)、改造、控制自然的 手段。要素

– 技術要素技能說 – 技術要素工具說 – 技術要素知識說

? 技術作為一個整體,既包括客體工具以及 由這些工具組合起來的機器等物質要素, 又 包括主體的知識、技能等精神因素, 是物質 形態(tài)與精神形態(tài)的統(tǒng)一體。

二、技術與科學的關系 ? 二者是不同的知識

– 科學關注 “ 事物是怎樣的 ”;技術關注 “ 事 情應怎樣做 ”。

– 明言知識在科學中所占的比例和位置比 在技術中更大、更突出, 而難言知識在技術 中比其在科學中占有更大的比例和更突出 的位置。? 目標不同

– 科學旨在揭示自然界固有的、不以的意志 為轉移的自然規(guī)律。

– 技術在于利用、干預和控制自然, 旨在有 所發(fā)明,創(chuàng)造新工藝和新產品。評判標準不同

– 科學的評判標準在于真理性 – 技術的評判標準在于有效性

三、科學與技術的聯(lián)系及其當代特點 ? 17世紀以前:科學與技術的相對獨立發(fā)展 – 起源于兩種不同傳統(tǒng)。

– 技術早于科學而出現(xiàn),在獨立于科學的狀 態(tài)下得到發(fā)展。

– 早期技術是經驗性、技能性的,操作者是 決定因素,具有封閉性和發(fā)展緩慢性。? 17-19世紀:科學與技術的聯(lián)姻

– 手工操作變?yōu)闄C器生產;匠人轉變?yōu)楣こ?師。

– 17-18世紀科學與技術的相互影響有限 – 19世紀,科學與技術都有了相當發(fā)展之 后,二者的相互作用才真正開始

? 當代科學與技術的一體化趨勢

– 17-19世紀中葉以前,科學普遍跟在技術 后面,力圖解釋技術發(fā)揮作用的現(xiàn)象,并使

之理論化,以便改進和再生產這些現(xiàn)象;– 19世紀后期開始科學與技術出現(xiàn)相互補

充的一體化趨勢。

– 科學為技術提供越來越多的理論貯備,技

術也越來越需要科學理論的指導和解釋。– 技術滲透到科學活動的各個環(huán)節(jié):為科學

研究提供技術手段;技術需要為科學研究指 明方向。

工業(yè)研究實驗室 —— 高科技園區(qū):產、學、研一體化的必由之路。– 工業(yè)研究實驗室,指從事非農業(yè)生產的私 人公司所維持和管理的從事研究和發(fā)展的

特殊機構。

– 20世紀,科學、技術與生產一體化趨勢日 益加強,高科技園區(qū)成為融產、學、研一體 化的新的組織形式。

? 體現(xiàn)了當代科學、技術與產業(yè)間的相互滲 透的時代特點 ? 有利于高素質人才的培養(yǎng)

? 有利于科學技術高效、快捷地轉化為現(xiàn)實 生產力。

? 使科研開發(fā)更有針對性和前瞻性。? 有利于解決高校辦學資金不足的困難,同 時使企業(yè)獲得更大收益。

第三章 科學方法論

第一節(jié) 獲取科學事實的基本方法

一、科學事實(一含義

科學事實是借助于科學語言對觀察和實 驗中所揭示的客觀存在的事件、現(xiàn)象和 過程的記錄和描述。

客觀事實是在時間和空間中客觀存在的 事件、現(xiàn)象和過程,是獨立于人的意識 之外的客觀存在。

聯(lián)系:客觀事實是科學事實的前提和基 礎;科學事實是客觀事實轉化的結果。區(qū)別:客觀事實不包含任何主觀因素, 無所謂對錯;科學事實包含有主觀認識 的因素,具有可錯性。

科學事實與經驗事實

經驗事實是人們借助于日常語言對生 產、生活實踐中所揭示的客觀事件、現(xiàn) 象和過程的描述或記錄。

聯(lián)系:具有可錯性;可以相互轉化。區(qū)別:反映途徑不同;科學價值不同。(二關于事實的幾種哲學觀點

觀點 1:存在客觀事實,科學事實能夠反映 客觀事實

觀點 2:否認客觀事實的真實存在,把客觀事 實與科學事實都看作是純粹主觀的 觀點

3、客觀事實即使存在,科學事實也不能 正確反映客觀事實。(三科學事實的特點

1、科學事實受理論影響

描述客觀事實的科學語言帶有理論成分。

2、個別性

科學事實是對特定觀察者的特定觀察對象 的記錄,所以是單稱陳述;是直接的,不 包括演繹推理。

3、可重復性

科學事實可重復檢驗?？茖W事實之所以可 以作為科學知識的基礎不在于它的正確 性,而在于它可以通過簡單明了的程序被 檢驗。

4、相對確定性(四科學事實的作用

1、科學事實是建立、發(fā)展科學理論的基礎。

2、科學事實是檢驗、評價科學假說、理論 的依據(jù)。

3、開辟新的科研領域,制定新的研究方法的 向導。

二、科學觀察

三、科學實驗

四、觀察與實驗中的機遇問題

五、觀察與理論的關系

1、觀察滲透理論

觀察主體滲透理論。觀察者所看到的東 西不僅僅取決于被觀察的事物, 而且還 依賴于觀察者的經驗、知識和期望。觀 察的內容、觀察資料的收集直至結果的 分析, 其中都蘊涵著觀察者原有的理論 知識。

觀察操作滲透著理論。觀察幾乎都要借 助一定的觀測儀器和設備來進行, 因此 要了解儀器、設備的基本構造原理、使 用范圍及其穩(wěn)定性;操作技能本身是理 論知識與實踐經驗的結合體。

“觀察語言” 滲透著理論。對觀察結果 的陳述必須以擁有合適的概念框架的 知識或理論為前提。

2、觀察應該滲透正確的理論 觀察中理論的滲透是避免不了的;要完成一個觀察過程必須理論的滲透,滲 透正確的理論對于完成觀察以及保證觀察 的正確性是必不可少的。

避免滲透錯誤的理論。第二節(jié) 科學假說與科學理論

一、科學假說的含義與特征(一含義

科學假說是根據(jù)已知的科學事實和科學原 理,對所研究的自然現(xiàn)象及其規(guī)律性提出 的一種假定性的推測和說明,是自然科學 理論思維的一種重要形式。

(二科學假說的特征 具有一定的猜測性 具有一定的科學依據(jù) 具有原則上的可檢驗性 原則上的可檢驗性指一個假說在 當時當?shù)厥軐嶒灄l件的限制不具 有可檢驗性, 但一旦條件具備, 就 可檢驗了。

4、一般來說,不應與科學家所處的背景知 識體系中已經經過嚴格檢驗的科學事實、規(guī) 律或理論相矛盾。

二、科學假說的作用

1、是形成和發(fā)展科學理論的必經途徑。

2、是發(fā)揮思維能動性的有效方法

3、不同假說的爭論有利于科學的發(fā)展

4、錯誤的假說對科學研究也有意義。

三、科學假說的形成(科學發(fā)現(xiàn)問題(一歸納主義學派

1、觀點

存在著一個形成假說的機械程序, 即歸納法。運用這個機械程序對觀察 材料進行加工整理, 就可以得出對該 現(xiàn)象進行解釋的假說?？茖W發(fā)現(xiàn)的過程包括四個階段 觀察和記錄一切事實 分析這些事實并加以分類 由之歸納地導出一般結論 進一步檢驗這些一般結論

2、評價

優(yōu)點:肯定了經驗材料和歸納邏輯在科 學發(fā)現(xiàn)中的作用。

缺陷:科學發(fā)現(xiàn)并非僅僅是機械邏輯推 理,更是充分發(fā)揮非邏輯思維的創(chuàng)造過 程。

觀察材料的收集離不開非邏輯思維。理論假說的提出離不開非邏輯思維。(二演繹主義學派

1、觀點

假說形成不受事實與理論的限制, 完 全是一個非邏輯思維過程。

2、評價

優(yōu)點:肯定了非邏輯思維在科學發(fā)現(xiàn)中 的作用。

缺陷:夸大了科學發(fā)現(xiàn)的非理性特征, 忽略了邏輯思維、科學事實、背景知識 在科學發(fā)現(xiàn)中的作用。(三辯證的觀點

假說的形成是一個綜合的思維過程,它 是在一定的背景知識和科學事實的基礎 上,通過邏輯思維(歸納、演繹、分析、綜合、比較、類比等 和非邏輯思維(想 象力、直覺、靈感、頓悟等的綜合使 用而形成的。

邏輯思維方法與非邏輯思維方法(自學

四、科學假說的檢驗(科學評價(一檢驗的三個步驟

1、從假說中推導出預期的可觀察事實的

陳述,即檢驗蘊涵。

2、設計實驗, 檢驗假說的檢驗蘊涵是否 符合事實。

3、作出檢驗論證

(二科學假說證實的邏輯及困難

1、證實的邏輯公式 H(待檢假說;O :檢驗蘊涵 I:初始條件;氣體的最初體積是 1升,最初壓力是一個大 氣壓(初始條件

從波義耳定律推出在溫度不變條件,當氣體 壓力增加到兩個大氣壓,氣體體積將會減少 到 1/2升。(由假說到檢驗蘊涵

現(xiàn)在將氣體壓力增加到兩個大氣壓,氣體體 積果真減少到 1/2升。所以,波義耳定律正確。

2、證實的困難

歸納的困難。觀察事實不能證實一個假 說,而只能確證一個假說,即只能對假 說提供一定程度的支持,因為假說的檢 驗蘊涵是無法窮盡的。

多種競爭假說的困難。對于一個或多個 檢驗蘊涵,邏輯上可以有無限的假說能 夠解釋

(三科學假說證偽的復雜性

1、證偽的邏輯公式

2、證偽的復雜性 實驗本身的可錯性

實驗條件不具備;觀察受理論影響;實驗操 作不當;儀器不精密等。初始條件的可錯性 輔助性假說的可錯性 假說剛剛提出時不完善

五、科學假說發(fā)展的趨勢(一科學假說的進化

在實踐檢驗中假說能夠說明的事實越來 越多,在科學研究中的意義越來越大,轉化 為理論的趨勢越來越明顯,這種情況被稱為 假說的進化。

判斷假說是否在進化不能只著眼于一時一 事,應全面分析。只要假說的基本觀念或核 心思想內容在發(fā)展中能得到保持而不被否 定,那就要估計假說進化的可能性,并努力 使假說得到發(fā)展。

發(fā)展假說需要從三個方面努力:

1、堅持假說的基本觀念或核心思想,不斷 充實內容,補充例證,深化認識。

2、適當修改假說,不斷清除錯誤內容,克 服弱點,彌補缺陷。

3、要有堅韌頑強的精神,敢于堅持不同觀 點。(二科學假說的退化

在檢驗過程中,假說的漏洞越來越多,能夠 說明的事實逐漸減少,在科學研究中的意義 越來越小,距離理論的要求越來越遠。這種 情況被稱為假說的退化。

退化假說所遇到的理論困難:

1、它對某些自然現(xiàn)象的解釋,逐漸同其他 學科領域中的規(guī)律發(fā)生矛盾,或者自相矛 盾。

2、它對一系列新發(fā)現(xiàn)的事實材料無法作出 合理解釋,從而暴露出觀點的破綻。

3、它原來所能解釋的事實,逐漸為對立的 假說更好的加以解釋。

第二篇：高中生物實驗方法總結

1．顯微觀察法：如“觀察細胞有絲分裂”“觀察葉綠體和細胞質流動”“用顯微鏡觀察多種多樣的細胞”等。

2．觀色法：如“生物組織中還原糖、脂肪和蛋白質的鑒定”“觀察動物毛色和植物花色的遺傳”“DNA和RNA的分布”等。

3．同位素標記法（元素示蹤法）：如“噬菌體浸染細菌的實驗”“恩格爾曼實驗”等。

4．補充法：如用飼喂法研究甲狀腺激素，用注射法研究動物胰島素和生長激素，用移植法研究性激素等。

5．摘除法：如用“閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素或生長激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在發(fā)育著的種子”等。

6．雜交法：如植物的雜交、測交實驗等。

7．化學分析法：如“番茄對Ca和Si的選擇吸收”“葉綠體中色素的提取和分離”等。

8．理論分析法：如“大、小兩種草履蟲的競爭實驗”“植物向性動物的研究”等。

9．模擬實驗法：如“滲透作用的實驗裝置”“分離定律的模擬實驗”等。

10．引流法：臨時裝片中液體的更換，用吸水紙在一側吸引，于另一側滴加換進的液體。

11．實驗條件的控制方法

⑴增加水中O2：泵入空氣或吹氣或放入綠色植物；

⑵減少水中O2：容器密封或油膜覆蓋或用涼開水；

⑶除去容器中CO2：NaOH溶液、Na2CO3溶液；

⑷除去葉中原有淀粉：置于黑暗環(huán)境（饑餓）；

⑸除去葉中葉綠素：酒精水浴加熱（酒精脫色）；

⑹除去植物光合作用對呼吸作用的干擾：給植株遮光；

⑺單色光的獲得：棱鏡色散或透明薄膜濾光；

⑻血液抗疑：加入檸檬酸鈉（去掉血液中的Ca2+）；

⑼線粒體提取：細胞勻漿離心；

⑽骨無機鹽的除去：HCl溶液；

⑾消除葉片中脫落酸的影響：去除成熟的葉片；

⑿消除植株本身的生長素：去掉生長旺盛的器官或組織（芽、生長點）；

⒀補充植物激素的方法：涂抹、噴灑、用含植物激素的羊毛脂膏或瓊脂作載體；

⒁補充動物激素的方法：口服（飼喂）、注射；

⒂阻斷植物激素傳遞：插云母片法。

12．實驗結果的顯示方法——實驗現(xiàn)象的觀測指標

⑴光合作用：O2釋放量或CO2吸收量或有機物生成量。例：水生植物可依氣泡的產生量或產生速率；離體葉片若事先沉入水底可依單位時間內上浮的葉片數(shù)目；植物體上的葉片可依指示劑（如碘液）處理后葉片顏色深淺。

⑵呼吸作用：O2吸收量或CO2釋放量或有機物消耗量

⑶原子或分子轉移途徑：同位素標記法或元素示蹤法

⑷細胞液濃度大小或植物細胞活性：質壁分離與復原

⑸溶液濃度的大?。篣型管+半透膜

⑹甲狀腺激素作用：動物耗氧量、發(fā)育速度等

⑺生長激素作用：生長速度(體重、體長變化)

⑻胰島素作用：動物活動狀態(tài)（是否出現(xiàn)低血糖癥狀——昏迷）

⑼胰高血糖素作用：尿糖的檢測（在尿液中加班氏試劑進行沸水浴，看是否出現(xiàn)磚紅色沉淀）

⑽菌量的多少：菌落數(shù)、亞甲基藍褪色程度

⑾生長素作用及濃度高低的顯示：可通過去除胚芽鞘后補充生長素后的胚芽生長情況來判斷（彎曲、高度）

⑿淀粉：碘液（變藍色）

⒀還原性糖：斐林試劑/班氏試劑（沸水浴后生成磚紅色沉淀）

⒁CO2：Ca(OH)2溶液（澄清石灰水變渾濁)

⒂乳酸：pH試紙

⒃O2：余燼復燃

⒄蛋白質：雙縮脲試劑（紫色）

⒅脂肪：蘇丹Ⅲ染液(橘黃色）；蘇丹Ⅳ染液(紅色）

⒆DNA：二苯胺（沸水浴，藍色）、甲基綠（染色后，呈綠色）

⒇RNA：吡羅紅（呈紅色）、苔黑酚乙醇溶液

第三篇：消化實驗方法總結

《豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究》

采用胃蛋白酶-胰酶兩步法，通過體外模擬雞體消化道內環(huán)境來比較不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，從而確定適合肉仔雞生長的較適宜豆粕粉碎力度。

平均粒徑采用GB 6971-86 方法，體外試驗采用Boisen和Fernandez等體外模擬消化方法。胃蛋白酶最適濃度的選擇

1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸緩沖液（pH=6.0 0.01M）+10ml鹽酸（0.2M）→溫和攪拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鮮胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌劑（青霉素+鏈霉素）→39℃恒溫水浴中震蕩6h,消化后+20%黃基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾→干燥后殘渣凱式定氮法測蛋白質含量→計算蛋白質和干物質消化率。確定最適胃蛋白酶濃度為75mg/ml.胰酶最適濃度選擇

在最適（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的產物中加入10ml磷酸緩沖液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氫鉀緩沖液配制）pH=6.8→39℃恒溫水浴中震蕩18h→消化后+20%磺基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾，干燥后殘渣按照凱式定氮法測其蛋白質含量，計算粗蛋白和干物質消化率，確定最適胰酶濃度為110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶兩步法測定過程[1]

分別稱取原樣和過篩豆粕于三角瓶中，4個重復，使用最適濃度測定不同粒度豆粕蛋白和干物質含量，并通過氨基酸自動分析儀測其氨基酸含量，計算粗蛋白、干物質和氨基酸消化率?！堆帑湻厶砑恿繉γ姘鼱I養(yǎng)組分含量和淀粉體外消化性的影響》 淀粉體外水解動力學測定

1g樣品+50ml磷酸緩沖液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴繼續(xù)消化→每隔15min分別取消化液0.2ml于25ml試管中+0.8ml蒸餾水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸餾水，搖勻→空白管調零，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液繪制標準曲表2，根據(jù)還原糖釋放量的變化比較淀粉的體外消化性。《苦蕎芽粉饅頭品質及體外模擬消化研究》 甲醇提取液的制備

參照Bojana(2011)提取樣品的方法并稍作修改。準確稱取5g待提取的苦蕎饅頭樣品浸沒于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均質機攪拌使樣品破碎均質。樣品液超聲波提取15min，將懸浮液轉移至離心管中。原樣品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重復一次，合并提取液。2500r/min離心，取上清液于45℃水浴下蒸發(fā)至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，備用。酚含量測定

采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）測定試樣的總酚含量，并稍作修改。取500μL蒸餾水，加入125μL的標準溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu試劑，充分混勻后加入1.25ml 7%碳酸鈉溶液，漩渦混勻后避光放置90min后于760nm處測定混合液的吸光值。以沒食子含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標，得回歸方程為y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照測定沒食子酸標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。黃酮含量測定

采用NaNo2-Al(NO)3方法測定。取一定濃度的樣品水溶液0.1ml與0.2ml 5%NaNO2溶液，漩渦混勻后室溫下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振蕩后靜止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波長510nm處測定混合液吸光值。以蘆丁含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標得回歸方程為y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。體外模擬消化過程

體外模擬消化過程參考Gawlik等人的方法，略作修改。

模擬唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模擬唾液，用磷酸鹽緩沖液調節(jié)溶液為pH=6.75。

模擬胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL調節(jié)溶液pH=1.2。模擬腸液：0.05g胰蛋白酶和0.3g膽汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。

體外提取過程（S0）：準確稱取6.0g蕎麥饅頭樣品浸沒于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，靜置6h，懸浮液轉移至離心管中，2500r/min離心10min，取上清液于45℃水浴下旋轉蒸發(fā)至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，備用。

口腔消化過程（S1）：準確稱取6g樣品置于100ml的燒杯中并加入30ml模擬唾液，用均質機攪拌使樣品充分破碎均質后放入水浴搖床中，37℃振蕩10min。

胃腸消化過程（S2）：取出水浴搖床中的樣品，用3mol/l的鹽酸調節(jié)溶液體系至pH=1.5后加入30ml模擬胃液，置于40℃水浴搖床中振搖60min。反應結束后取5ml的樣液，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，經過模擬胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3調節(jié)使溶液體系的pH=6，加入30ml膽汁胰酶的復合液，再分別加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震蕩120min模擬腸道消化，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，-20℃保存?zhèn)溆?。每個樣品重復三次。

腸道吸收過程（S3）：將20ml剩余消化液轉移到透析袋中，并將透析袋置于裝有50ml PBS緩沖液的燒杯中，37℃水浴震蕩4h。將PBS緩沖液轉移到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?，每個樣品重復三次。

《羊奶嬰兒配方奶粉中蛋白質體外模擬消化研究》 外模擬胃消化

體外模擬胃消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數(shù)為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于

37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節(jié)乳液p H值至7滅酶，測定其中蛋白質的胃消化率。體外模擬腸消化

體外模擬腸消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數(shù)為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的Na OH調乳液p H7。在每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的腸消化率。體外模擬總消化

體外模擬總消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數(shù)為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節(jié)乳液p H值至7。再向每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的總消化率。燕麥全粉中蛋白質體外消化的測定

燕麥蛋白質的體外消化實驗采用Wang[15]報道的體外消化模型進行,略有改動。具體操作如下:準確稱取一定質量的樣品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中預熱5 min,以酶∶底物為1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒溫振蕩器上反應,分別在不同的消化時間(0、10、30、60、120 min)取樣,用1 mol/L的NaOH調節(jié)pH7.0終止消化反應,120min所得的消化液調節(jié)pH7.0后,以酶∶底物為1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取樣分析。

第四篇：RT-PCR實驗方法總結

RT-PCR實驗方法總結大全

RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：

1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不會出太大問題。

3.PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須

在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續(xù)擴增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov問題：

在做RT-PCR遇到一怪現(xiàn)象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解?。ㄗⅲ阂芽隙ㄔ摶蛟趦煞N組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）

從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：

1.RT-PCR有兩種做法：

條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR應具備的條件

高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內標分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE 我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無

RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關內參：

RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統(tǒng)一配，拍照后，算目的基因和內參的比值，這就是基因表達的相對濃度。

問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？ 答： it should determined the amount of RNA.but it not for the quantitity of the PCR.it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR)and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much.but the amount just using “accurate piptte” is wrong.it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。

關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。

有關內參的建議：

一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的

電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。

2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數(shù)期，只不過碰巧2的冥和2的倍數(shù)是相同的?？瓷先ト魏我粋€時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫(yī)的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這 圖我在 *** 帖過。關于引物設計，再可能的情況下，除了常規(guī)要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據(jù)要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。

引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。

我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發(fā)現(xiàn)呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內含子的問題呢？

18s的引物也和著名的βactin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數(shù)量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。PE有專門的用于實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。

正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。

有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？

原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。

我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條,許多專業(yè)書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。

記得我開始我的ＲＴ－PCR時，按常規(guī)方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了Ｎ次均沒有結果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產物做模版再進行ＰＣＲ時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了９mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制

請問： 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據(jù)gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？ PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標準？ 3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？

一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.如果內參照有,目的沒有,至少證明不是“美麗惹”的禍.原因書里應該都說了.在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。

5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

2.異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分離與純化

真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA

一、試劑準備

1．3M醋酸鈉（pH 5.2）2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。

4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC

二、操作步驟

1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC處理的1ml注射器或適當?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。

3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。

5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10.用適量的DEPC H2O溶解RNA。

三、注意事項

1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。

5．一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。

RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點： 1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2． 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。

3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。

4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。5． RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。

一、試劑準備

1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2.雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3.RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4)20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml)8μl、RNase T1(250U/μl)1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。（1）設計含T7啟動子的PCR引物

由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列:

T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：

上游引物

下游引物Ⅱ T7 啟動子序列

下游引物Ⅰ

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節(jié))。

（3）探針合成標記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin（40U/μl）0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl

DTT(二硫蘇糖醇，0.1M)1μl

5×轉錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl）1μl

T7 RNA 聚合酶(15U)1μl

混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl 氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl）4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用?？捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節(jié)電泳步驟）。

2．雜交

（1）RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據(jù)探針檢測結果調整）于0.5ml 離心管中。

（2）80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。

3.消化

(1)雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。

(2)加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。

(3)加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

(4)轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。

(5)棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

（1）配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1）6.25ml

5×TBE 10ml 尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

（2）預電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。

（3）加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。

（3）電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項

1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3、同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。

4、RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞

說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了

如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設計個更長的了 第二次的引物設計要求可以低一點 以50μl體系為例 引物各1μl 第一次PCR產物5μl

二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應，以期增加產物的量

我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測OD260和OD280,后根據(jù)公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好.luoyu10 wrote: 各位大哥：

我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？

最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。

問：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想請教引物如何設計？

好的引物所具有的令人滿意的特點：

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 設計5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

【經驗】如何確認RNA的質量 各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考??！

以下兩種方法，相信大家都知道的： 1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。

如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。2）RNA的電泳圖譜

一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據(jù)我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。

電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的（見下圖）。

以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。

下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。3）保溫試驗

方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。

如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續(xù)的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了！

第五篇：實驗總結-細胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細胞常用配置

培養(yǎng)基的配置：基礎培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺內，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關閉工作臺打開紫外燈照射30min后開始實驗操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細胞復蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。超凈臺內準備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個培養(yǎng)皿并做好標記（復蘇日期等），提前加入5-10ml培養(yǎng)液；離心結束后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養(yǎng)皿內。

7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)

注意事項：

1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液

6.復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

三、培養(yǎng)液的更換

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶內吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。

四、細胞傳代

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內。

5.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據(jù)細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。

7.取1或2個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個培養(yǎng)瓶內（注意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進行1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基皿內吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿內，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。

9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。

五、細胞株的保存

原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失。如果細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。

實驗步驟：

選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復常溫，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內。

5.將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內。6.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據(jù)細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。

7.將懸浮細胞吸入15ml離心管內，加入4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min 8.預先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數(shù)量備用 9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進行重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。

10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內長期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍睾袃?，放入-80℃冰箱內過夜后最后存放于液氮罐內。（梯度降溫盒內為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫）

六、細胞轉染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊?，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動了細胞質內靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。

? 病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應。

作用機制

1)其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

4)siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

脂質體轉染原理：

1.脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體 2.陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達

DNA轉染步驟

1.轉染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞達到90-95%每孔。

2.轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。

4.B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉染時間待定）。8.第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9.同時設立細胞對照組，空白轉染組。

siRNA轉染步驟

1)轉染前一天接種細胞于6孔板（40x104），2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞達到50-60%每孔。

2)轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。（siRNA按照說明書稀釋）4)B液：脂質體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉染時間待定）。8)第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9)同時設立細胞對照組，空白轉染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進行轉染實驗

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈的DEPC水至管內，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來 2)溶解時滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標記GAPDH，NC，NV-FAM，三個片段名稱，從管內吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個35mm培養(yǎng)皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長培養(yǎng)基。使細胞在轉染的時候有50-60%的融合率

? 從細胞中除去生長培養(yǎng)基

? 每個孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養(yǎng)基，并準備如下混合物 1)A液：(取7個EP管，分別標記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個EP管標記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養(yǎng)皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時 ? 更換含血清的培養(yǎng)基并培養(yǎng)細胞24-48小時 24-48小時后收細胞跑WB，看沉默效果