第一篇：EM菌生態(tài)菌的養(yǎng)蠶使用方法 生態(tài)養(yǎng)蠶技術(shù)

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EM生態(tài)菌液的養(yǎng)蠶使用方法 生態(tài)養(yǎng)蠶技術(shù)

一、EM生態(tài)菌液用在桑樹：

1、用EM生態(tài)菌液稀釋成500倍，即EM生態(tài)菌液1：紅糖1（用暖水溶解后）加水500斤，淋于桑樹木頭。

2、稀釋500倍，即EM生態(tài)菌液1：紅糖1加水500斤混合稀釋后用噴霧器（未用過(guò)農(nóng)藥）噴灑蠶桑葉面，每隔10天噴一次。

3、發(fā)酵蠶屎撒在蠶桑地上，方法是：先把蠶屎曬干，然后用100倍稀釋液發(fā)酵，即EM生態(tài)菌液1：紅糖1加水100斤均勻噴灑在蠶屎上，然后將蠶屎裝入有膠紙的尼龍袋，扎好袋口（夏季6天，冬天10天）蠶屎發(fā)出酒曲香氣味，說(shuō)明成功，可撒在桑地上。如果是酸臭味，說(shuō)明失?。ㄋ葸^(guò)多），應(yīng)重新發(fā)酵，直到成功為止。

二、EM生態(tài)菌液噴桑葉喂蠶：

用本品和冷開水（清潔水）配成稀釋液，細(xì)霧噴濕桑葉，稍干后于當(dāng)天第二餐添喂。具體用法：⑴、2—4齡蠶：按1：100配成稀釋液，,即1瓶蓋（5ml）+冷開水或清潔水1—1.2斤；⑵、5齡蠶：按1：50配成稀釋液，即10瓶蓋+水4.5—5.5斤。注意：備專用噴壺。水要清潔，不能有農(nóng)藥殘留或油污。細(xì)霧噴灑，邊噴邊翻動(dòng)桑葉。根據(jù)天氣和桑葉的干濕度，可適當(dāng)增、減水加入量。陰雨天要把桑葉稍晾干再喂。遇炎熱天氣，4—5齡蠶，每天可多喂一次EM原露噴濕的桑葉。五齡蠶時(shí)，可將桑葉撒在蠶座上，然后噴霧桑葉，這樣省工省時(shí)。一張蠶種用EM原露500—750ml，效果最佳。

三、EM生態(tài)菌液對(duì)桑葉保鮮：

按1：300配成稀釋液，即1瓶蓋+水3斤，均勻噴濕桑葉，按常規(guī)方法裝入無(wú)毒塑料袋或缸桶中，24小時(shí)內(nèi)不發(fā)黃不變質(zhì)。

地址：北京市海淀區(qū)上地三街

電話：010-62669720

官方網(wǎng)址：004km.cn

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四、EM生態(tài)菌液噴施桑園可增產(chǎn)：

按1：300配成稀釋液，即1瓶蓋+水3斤，噴灑桑樹，10天噴灑一次。葉噴給桑樹提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)光合作用，增加葉綠素含量，使桑葉寬厚油綠，質(zhì)量好產(chǎn)量高。

五、EM生態(tài)菌液噴蠶體可消毒除臭。

夏秋季氣溫較高，可直接將EM混合液噴在蠶體上，然后再將桑葉撤在蠶座上噴蠶。除常規(guī)用藥消毒蠶體蠶座外，中午、晚上氣溫高時(shí)用此法喂蠶，膿病、僵病得到很好的抑制，蠶病減少。用此法可消除蠶糞的臭味，優(yōu)化蠶的生長(zhǎng)環(huán)境和蠶農(nóng)的工作環(huán)境。EM液濃度為1：300倍。

使用效果：

一是蠶兒食桑快而干凈，幾乎一觸及桑葉就食，連葉脈都食完。而對(duì)照蠶撒葉數(shù)分鐘后才開始食用，并且殘桑多。二是蠶的抗病力強(qiáng)，病蠶少，死亡率低，僅為0.85%。三是增產(chǎn)效果好，與對(duì)照區(qū)相比，試驗(yàn)區(qū)結(jié)繭率提高30.5%，公斤繭粒數(shù)減少169粒，減少21.2%，而且蠶繭大，繭質(zhì)好，等級(jí)高，賣價(jià)好。

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第二篇：em菌水蛇養(yǎng)殖技術(shù)

水蛇除喜食各種淡水雜魚、泥鰍外，還尤喜歡黃鱔和各種蛙類。應(yīng)根據(jù)容易捕獲的季節(jié)或水蛇的育肥特按時(shí)投喂，盡量使投餌種類多樣化，滿足其身體生長(zhǎng)的需要。大多數(shù)水蛇食欲旺盛，每隔4-5天便要攝食一次。一般條重約100-200克的水蛇，每次可吞食1-2條小雜魚，多者可達(dá)3-4條。水蛇的膽量非常的大，飲食過(guò)程中有旁人的打擾也不會(huì)影響到它正常飲食。但是在水蛇進(jìn)食后，就不要在過(guò)分的驚擾水蛇了，否則會(huì)將吞入腹中的食物吐出來(lái)。不僅會(huì)延遲下一次的進(jìn)食時(shí)間，還會(huì)減少應(yīng)有的進(jìn)食量，對(duì)水蛇的生長(zhǎng)極為不利。飼養(yǎng)水蛇是目前人工養(yǎng)殖蛇類中死亡率最低的品種，只要飼養(yǎng)者采取科學(xué)的喂養(yǎng)方法，注重水蛇生長(zhǎng)的環(huán)境健康，水蛇就能夠健康的成長(zhǎng)。

益富源水產(chǎn)em菌液|水產(chǎn)em菌種|水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)制劑|em原液|em原露|改善水質(zhì)|增加含氧量|減少病原微生物及不良藻類|預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物皮膚病發(fā)生|改善腸道環(huán)境預(yù)防腸道疾病發(fā)生|em原種|em益生菌|益富源em菌正規(guī)廠家直營(yíng) 產(chǎn)品介紹：

本品由放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌等單一菌種經(jīng)特殊工藝研制而成的高效復(fù)合微生物菌液。每毫升含有益總菌數(shù)≥200億CFU [產(chǎn)品名稱]益富源水產(chǎn)em菌

[主要成分]放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌 [用法用量]

1、池塘養(yǎng)殖，放苗或水花前3-4天每畝用2000ml全池潑灑，放苗或水花時(shí)，用1公斤兌水100公斤，浸泡15分鐘，每畝潑灑2公斤,以后每隔15-20天噴灑一次，每畝用2公斤潑灑。

2、水庫(kù)使用，每畝按2-3公斤稀釋使用一次，每15天使用一次，最好配合使用有機(jī)復(fù)合肥，這樣效果更佳。

3、特種水產(chǎn)養(yǎng)殖（水蛇，甲魚、蝦、鰻魚、桂魚、各種熱帶魚等），（1）環(huán)境處理：放水前一周，用100倍菌液代替石灰均勻噴灑凈化環(huán)境。放養(yǎng)前3天，用為20萬(wàn)分之一的菌液稀釋液潑灑水面，放養(yǎng)后每15天噴灑一次，水質(zhì)較差的地方應(yīng)加大濃度，并縮短潑灑間隔時(shí)間。（2）調(diào)節(jié)水質(zhì)：在每次換水后潑灑菌液稀釋液（濃度為20萬(wàn)分之一），可潑在增氧機(jī)旁或進(jìn)水口，通過(guò)機(jī)器和水流作用擴(kuò)散有益微生物，以利最短時(shí)間分解有害物質(zhì)，盡快穩(wěn)定水質(zhì)。蝦類、甲魚等養(yǎng)殖品種每月潑灑稀釋液2-3次，發(fā)病季節(jié)適當(dāng)增加用量。

水蛇肉質(zhì)雪白細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，且有較高的藥用和食療價(jià)值，能促進(jìn)傷口愈合、健膚美容、舒筋活血，被廣東、香港、澳門人視為滋補(bǔ)佳品，在廣州及珠江三角洲等地有的地方還開設(shè)有水蛇食街或水蛇粥城。廣東從2003年下半年禁食野生動(dòng)物開始，其他各種陸上野生蛇類均在禁售、禁食之列，只有人工養(yǎng)殖的水蛇仍在市場(chǎng)出售和在賓館、酒樓供應(yīng)食客，但因需要量較大而養(yǎng)殖數(shù)量不多導(dǎo)致貨源較緊，價(jià)格漲高，據(jù)預(yù)測(cè)其售價(jià)仍有上升趨勢(shì)。

水蛇人工養(yǎng)殖技術(shù)簡(jiǎn)單，成本低，發(fā)展空間大，市場(chǎng)前景十分廣闊。投資8000元建一個(gè)小型生態(tài)水蛇場(chǎng)，1個(gè)勞動(dòng)力飼養(yǎng)種蛇100組(1公3母為1組)400條，辦場(chǎng)第二、第三、第四年的純收入分別為8144元、1．19萬(wàn)元、5．2萬(wàn)元。以建設(shè)與投資效益分析。

水蛇場(chǎng)建設(shè)

飼養(yǎng)400條種蛇，需10平方米種蛇池4個(gè)、3平方米幼蛇養(yǎng)殖過(guò)渡池4個(gè)、100平方米商品蛇飼養(yǎng)塘3個(gè)、活體飼料生產(chǎn)房1間、水生飼料生產(chǎn)塘1個(gè)、蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)1個(gè)。

1．種蛇繁殖池：長(zhǎng)4米、寬2．5米、深1．1米，磚水泥結(jié)構(gòu)，池底保持淤泥30厘米厚。

2．幼蛇養(yǎng)殖過(guò)渡池：長(zhǎng)2米、寬1．5米、深0．6米，磚水泥結(jié)構(gòu)，池底保持淤泥20厘米厚。蛇池可并排建，池底向排水端呈5％坡度傾斜，深處池底有排水孔通向池外排水溝進(jìn)出水口分別設(shè)在長(zhǎng)方形養(yǎng)殖池的對(duì)角線上。兩池之間設(shè)有人行道。

3．商品蛇飼養(yǎng)塘：面積100平方米，深1．2米，四周建有1米高的防逃墻。

4．活體飼料生產(chǎn)場(chǎng)地：

①活體飼料生產(chǎn)房1問(wèn)10平方米，用于生產(chǎn)黃粉蟲和EM活菌制劑；

②50平方米小池塘1個(gè)，用于生產(chǎn)水生飼料；

③在池塘邊建一個(gè)50～70平方米的蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)。

第三篇：桑田全生態(tài)自然耕作養(yǎng)蠶實(shí)踐報(bào)告

桑田全生態(tài)自然耕作養(yǎng)蠶實(shí)踐報(bào)告

通過(guò)對(duì)廣東郁南、乳源、翁源等地區(qū)桑田養(yǎng)蠶情況的觀察得知，由于長(zhǎng)期的化肥使用或短肥種植，造成桑葉營(yíng)養(yǎng)缺乏，養(yǎng)殖的蠶繭偏小，蠶蟲發(fā)病率彼大，且蠶絲質(zhì)量品質(zhì)不高，該如何解決這些問(wèn)題？通過(guò)實(shí)踐，較理想的方法，也有可能是未來(lái)桑蠶業(yè)發(fā)展之道：桑田全生態(tài)自然耕作，就是利用生物酶酵素的新陳代謝功能，將農(nóng)藥化肥及過(guò)量毒素等，從桑樹體，尤其是桑樹頭中排除，促發(fā)新的根系，增加葉綠素，光合更豐富的營(yíng)養(yǎng)成份至桑葉，并徹底解決農(nóng)藥化肥污染，再用微生物技術(shù)配合生物肥料，即采用將蠶屎利用微生物發(fā)酵為生物肥施灑桑田。

一、生物肥料桑田的優(yōu)勢(shì)

一般農(nóng)戶養(yǎng)殖桑蠶種1-3兩批，每月二批，可有蠶屎300百斤至1000斤，傳統(tǒng)方法堆放到年底，做為普通肥料施到桑田，有些桑戶無(wú)處堆放就丟掉或直接施入桑田，造成病菌傳染，影響蠶蟲生長(zhǎng)。桑農(nóng)對(duì)桑田在降枝后進(jìn)行施肥，約每畝地一百斤化肥，有效肥力25%的化肥75元100斤，有效肥力48%(氮16-磷16-鉀16)的化肥125元100斤，全年肥料成本需投入500-1000元，許多桑戶能省則省，不愿施肥，更重要的是桑農(nóng)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施化肥對(duì)桑樹頭壽命和發(fā)枝葉有嚴(yán)重影響，蠶蟲結(jié)繭也一年不如一年，現(xiàn)在的繭重量比十幾年前普遍減輕40%，平均重量只有1.6克，能夠達(dá)到2克的已是養(yǎng)蠶高手。

利用微生物技術(shù)對(duì)蠶屎進(jìn)行發(fā)酵，使其成為生物肥料，桑戶可節(jié)省養(yǎng)蠶成本，更重要的優(yōu)點(diǎn)是生物肥沒(méi)有化學(xué)污染，對(duì)蠶蟲健康和正常生理生長(zhǎng)有良好的推動(dòng)。應(yīng)用生物肥和生物酶酵素新陳代謝技術(shù)的桑田三個(gè)周期后，蠶繭可達(dá)3-4克，同時(shí)對(duì)桑樹壽命及生長(zhǎng)有極大的支持，生物肥料桑田的桑葉可提前十天產(chǎn)葉并達(dá)到增產(chǎn)50%的效果。< ~ 課 件 >由于生物肥料是桑農(nóng)利用自家蠶屎生產(chǎn)，農(nóng)戶只需購(gòu)買生物肥專用微生物菌種，每200斤生物肥料成本僅10元以下，較之任何化肥成本都低90%以上，更重要的是肥力更好，不污染土質(zhì)。生物肥的氮磷鉀添加也可與農(nóng)戶自有植物材料條件就地解決，比如柴草灰、農(nóng)作物粕渣等都是良好的氮磷鉀來(lái)源。

二、生物酶酵素新陳代謝技術(shù)使用與生物肥生產(chǎn)使用流程

1.降桑枝葉后施除草劑，待草萎枯后灑施自產(chǎn)生物肥每畝50市斤，并用生物酶酵素2號(hào)噴灑桑樹頭，促根系擴(kuò)張，待桑枝新芽葉片約拇指大小時(shí)噴灑生物酶酵素1號(hào)，促新根及葉片生長(zhǎng)。之后每7-10天向桑葉噴灑生物酶酵素1號(hào)一次，三至四次為一個(gè)周期。

2.降枝葉日始計(jì)，第二十五天后，可采摘第三四片葉飼養(yǎng)蟻蠶?？刹烧谖辶~飼養(yǎng)三四眠中蠶。

3.第四十天后，可剪枝葉飼養(yǎng)五齡蠶。

4.五齡蠶后降枝桑樹進(jìn)行新一輪生物肥料和生物酶酵素技術(shù)周期，如此周而復(fù)始。經(jīng)過(guò)幾輪周期，土地和桑樹進(jìn)入有機(jī)生物狀態(tài)，蠶蟲獲得無(wú)毒侵害后生理健康，病情減少，繭絲量必然達(dá)到增幅。

5.蠶屎生物肥生產(chǎn)流程：桑蠶上樸吐絲后，將蠶屎收集，清除桑枝，將其與四眠前蠶屎一起堆積，根據(jù)重量計(jì)算混合適當(dāng)比例的生物菌種，蠶屎濕度水分控制在20%-30%之間，經(jīng)七天發(fā)酵，可以立即使用。

6.蠶屎生物肥的氮磷鉀及微量元素份量，可通過(guò)植物農(nóng)作物進(jìn)行同時(shí)發(fā)酵調(diào)整。

7.桑田桑樹所需的氮磷鉀在蠶屎生物肥基本上中已經(jīng)具備，如還需要，可根據(jù)土地、氣候、季節(jié)及桑樹長(zhǎng)勢(shì)等調(diào)節(jié)氮磷鉀比例份量，尤其是鉀元素蠶屎中較少，在發(fā)酵時(shí)加入5%-10%的柴草灰即可。氮的添加可用適量植物果粕，磷鈣因養(yǎng)蠶各階段使用石灰消毒，基本無(wú)需添加。

8.蠶屎生物肥也可以增加桑農(nóng)收益。桑戶養(yǎng)蠶量大，蠶屎生物肥使用有余，可出售給種植果樹的果農(nóng)使用，或出售給有機(jī)肥料廠為原料。

三、生物技術(shù)是天然彩色繭絲桑蠶的發(fā)展基礎(chǔ)

全生態(tài)自然耕作對(duì)桑田桑樹的運(yùn)用，確保了養(yǎng)殖蠶蟲不受化肥農(nóng)藥的污染，除了繭絲量增加之外，對(duì)雜交或基因改造的可吐彩色絲的桑蠶，在雜交性能和基因穩(wěn)定方面起到巨大的支持。生物酶新陳代謝技術(shù)促進(jìn)桑樹光合，提高桑葉營(yíng)養(yǎng)和產(chǎn)量，日前在廣東郁南東壩鎮(zhèn)龍?zhí)链宥鄠€(gè)農(nóng)戶示范田取得高品質(zhì)蠶繭增產(chǎn)40%的效益。

廣東省致富委組織桑蠶高產(chǎn)技術(shù)示范小組，對(duì)廣東云浮、英德、乳源、翁源等地實(shí)地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)的桑農(nóng)因桑田土壤、蠶種、養(yǎng)殖條件、技術(shù)、習(xí)慣的差異之外，桑蠶繭質(zhì)量普遍處于低水平，繭重量平均只有1.6克以下，每?jī)尚Q種產(chǎn)繭量（吐絲三天出售的濕繭統(tǒng)計(jì)）在70－110市斤之間，且蠶蟲體弱常造成桑農(nóng)收不保本。部分地區(qū)的桑戶十畝地才月二批養(yǎng)殖二兩蠶種。

五月二十六日開始，省致富委桑蠶高產(chǎn)技術(shù)推廣小組在東壩鎮(zhèn)龍?zhí)链寮爸苓厧讉€(gè)村選擇不同桑田，養(yǎng)殖技術(shù)也有高低差異的十戶進(jìn)行全生態(tài)自然耕作的高產(chǎn)技術(shù)示范。為使桑農(nóng)三十天內(nèi)了解高產(chǎn)技術(shù)的魔力，采取噴灑桑樹大葉，分別對(duì)蟻蠶到五齡蠶；三眠蠶到五齡蠶進(jìn)行對(duì)比飼養(yǎng)，并對(duì)桑農(nóng)準(zhǔn)備放棄養(yǎng)殖的二眠體弱蠶搶救性喂食，均取得30%-44%的繭增產(chǎn)。

同批蠶種，沒(méi)有噴施新陳代謝生物酶的桑樹葉飼養(yǎng)的蠶結(jié)繭重量平均為1.6克，噴施新陳代謝生物酶的桑樹經(jīng)促進(jìn)光合的桑葉飼養(yǎng)蠶結(jié)繭重量平均達(dá)到2.33克，且色澤較更亮白。

郁南東壩鎮(zhèn)是廣東的桑蠶養(yǎng)殖大鎮(zhèn)，擁有一萬(wàn)多畝的桑田，僅龍?zhí)链迳暨_(dá)八百多戶。一般每戶桑田有七、八畝，每月二批養(yǎng)殖蠶種2-3兩，售繭量（吐絲三天濕繭計(jì)）為150-280斤。高產(chǎn)技術(shù)實(shí)施第一個(gè)月的增產(chǎn)幅度就給桑蠶戶帶來(lái)180-350斤的變化。

根據(jù)示范戶實(shí)踐總結(jié)，桑樹系更為發(fā)達(dá)，葉增產(chǎn)，光合作用強(qiáng)勁，葉的營(yíng)養(yǎng)含量大幅增加，從而使飼養(yǎng)的桑蠶體質(zhì)健康，成繭重量預(yù)計(jì)可達(dá)4克/個(gè)。桑農(nóng)在相同勞動(dòng)和成本投入中可獲得三倍收益。

第四篇：em菌在水產(chǎn)中的運(yùn)用 文檔

控制水環(huán)境中氨、硫化氫等有害物質(zhì)含量，調(diào)控養(yǎng)殖池微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)； * 增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能，預(yù)防病害，增進(jìn)健康，降低發(fā)病率及死亡率； * 促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增重，增加產(chǎn)量；

* 無(wú)污染，成本低，收效大，改善肉質(zhì)；

* 凈化水質(zhì)，改善環(huán)境，延長(zhǎng)換水間隔；

* 減少病原菌，平衡微生態(tài)，減少藥物的使用，保障環(huán)境安全。

1.減少病原微生物和不良藻類；明顯增強(qiáng)養(yǎng)殖對(duì)象的免疫力和抗病性，降低發(fā)病率，提高成活率。用戶反映，益生菌原液可使蟹苗成活率提高近一倍，中華石斑魚的成活率由原來(lái)的30％提高到70％以上。

2.增加有益微生物數(shù)量。水面浮游動(dòng)物、有益藻類增多，特別是紅蟲不斷增多至布滿水面。

3.穩(wěn)定和改善水質(zhì)，水體顏色清爽，不臭不腐，無(wú)硫化氫、氨氣等異味，能見(jiàn)度在25-50cm的時(shí)間長(zhǎng)且較穩(wěn)定，換水時(shí)間可延長(zhǎng)2倍以上。

4.魚蝦糞、池底雜質(zhì)和下腳料不會(huì)變成淤泥而呈散沙狀。

5.促進(jìn)生長(zhǎng)，增重率明顯提高。實(shí)踐證明，在同等環(huán)境下，使用益生菌原液后，可提前上市，平均畝產(chǎn)提高20％-35％，產(chǎn)卵量增加，產(chǎn)卵時(shí)間延長(zhǎng)。且孵化率較好；餌料不臭，改善養(yǎng)殖環(huán)境。

百豐EM菌液用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，可改善水質(zhì)，提高成活率和相對(duì)生長(zhǎng)率，降低發(fā)病率，提高肉質(zhì)品質(zhì)，用百豐水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)飼料、糞肥進(jìn)行發(fā)酵，可提高營(yíng)養(yǎng)成分和飼料效率，大幅度降低飼料系數(shù)和養(yǎng)殖成本。

用百豐EM菌液養(yǎng)殖青蝦，增產(chǎn)35%以上，商品率提高20個(gè)百分點(diǎn)；在池塘中養(yǎng)殖河蟹，成活率達(dá)91%，平均規(guī)格增0.88兩，在湖泊網(wǎng)圍中養(yǎng)蟹使用二個(gè)月，平均個(gè)體規(guī)格達(dá)0.277兩，比對(duì)照池增大近一倍，死亡率幾乎為零；在溫室養(yǎng)鱉中應(yīng)用，生長(zhǎng)率提高28%，飼料系數(shù)下降0.65，換水時(shí)間延長(zhǎng)4倍；河豚越冬，凈增重增長(zhǎng)63.4%，成活率提高36個(gè)百分點(diǎn)；用百豐水產(chǎn)菌液潑灑水體養(yǎng)殖鱖魚，成活率達(dá)90%；常規(guī)魚養(yǎng)殖應(yīng)用飼料發(fā)酵方法，畝產(chǎn)增24.7%，精料系數(shù)下降27.2%。此外，在蚯蚓、黃鱔及海珍品上應(yīng)用效果也十分顯著。試驗(yàn)還證明：百豐水產(chǎn)菌液可替代或大幅度減少藥物的用量，可防治大多數(shù)病害，控制病毒復(fù)制蔓延（尤其對(duì)河蟹顫抖病病毒、鱖魚病毒、鮑魚病毒的預(yù)防效果顯著）；改善養(yǎng)殖環(huán)境，使魚蝦蟹恢復(fù)和保持自然本色。百豐EM菌液無(wú)毒無(wú)害，無(wú)任何藥物殘留，是實(shí)施健康養(yǎng)殖、生產(chǎn)綠色食品，爭(zhēng)創(chuàng)品牌，發(fā)展創(chuàng)匯漁業(yè)和生產(chǎn)味道鮮美的水產(chǎn)品的高新技術(shù)。

北京百豐天下生物科技有限公司

王華龍：***

第五篇：沙門菌檢測(cè)技術(shù)

沙門菌為常見(jiàn)的腸道病原菌之一，在自然界分布廣泛，種類繁多，所致疾病統(tǒng)稱沙門菌感染，其中由傷寒、副傷寒沙門菌引起的急性全身系統(tǒng)性傳染病是我國(guó)《傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病，而由非傷寒沙門菌引起的食物中毒則占我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的首位。

及時(shí)準(zhǔn)確地檢驗(yàn)沙門菌，為診斷和控制由該菌引起的疾病提供依據(jù)。沙門菌檢驗(yàn)程序主要包括：標(biāo)本采集、標(biāo)本的處理與接種、菌株分離與鑒定和PCR檢測(cè)幾個(gè)步驟。

標(biāo)本采集

標(biāo)本采集前，應(yīng)準(zhǔn)備好所需的培養(yǎng)基和器材，主要有：血液需氧培養(yǎng)瓶、血瓊脂平板、XLD（木糖賴氨酸脫氧膽鹽）瓊脂平板、BS（亞硫酸鉍）瓊脂平板、SC（亞硒酸鹽胱氨酸）增菌液、酒精燈、采樣瓶、剪刀、鑷子等。

沙門菌檢驗(yàn)標(biāo)本主要分為：食品樣品、可疑食物中毒標(biāo)本，沙門菌患者標(biāo)本?？梢墒澄镏卸緲?biāo)本主要有：可疑食品、相關(guān)環(huán)境標(biāo)本、疑似病人標(biāo)本?？梢墒称返牟杉涸诓杉梢墒澄镏卸緲?biāo)本時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)采集剩余食物以及食品加工有關(guān)的炊事用具，操作人員的手、肛試等相關(guān)環(huán)境標(biāo)本。采樣時(shí)，用棉試子涂抹物品表面后，置于少量增菌培養(yǎng)基內(nèi)，也可根據(jù)情況在接種現(xiàn)場(chǎng)接種分離平板。

沙門菌感染患者標(biāo)本的采集：沙門菌感染患者應(yīng)采集新鮮糞便標(biāo)本或肛試子直接接種分離平板和增菌液。對(duì)傷寒、副傷寒患者，在病程的第1~2周，可采集靜脈血液4~8ml，接種血液需氧培養(yǎng)瓶中。

每個(gè)標(biāo)本需做好標(biāo)識(shí)和記錄，采集的食品樣品4℃保存，已接種標(biāo)本的增菌液和培養(yǎng)基，室溫下保存，2小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

標(biāo)本的處理與接種

沙門菌標(biāo)本的處理與接種常用培養(yǎng)基有：TTB（四硫磺酸鈉）增菌液、SC(亞硒酸鹽胱氨酸)增菌液、XLD瓊脂平板、BS瓊脂平板和麥康凱（MaC）瓊脂平板。

可疑中毒食品標(biāo)本的處理：對(duì)采集的標(biāo)本通常按1:10的比例分別接種于100mlTTB和100ml增菌液中，每瓶增菌液加入標(biāo)本約10g，同時(shí)還可將可疑中毒食品標(biāo)本直接接種于分離平板。將接種后的TTB增菌液置42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，將SC增菌液和分離平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。取培養(yǎng)后增菌液轉(zhuǎn)種XLD瓊脂平板和BS瓊脂平板，將接種后的平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時(shí)，待觀察。

血液（骨髓）標(biāo)本的處理：將已接種標(biāo)本的血液培養(yǎng)瓶直接放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，在培養(yǎng)期間分別于培養(yǎng)的第1天、第2天和第7天取培養(yǎng)液一環(huán)接種血瓊脂平板，將平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。培養(yǎng)至第7天時(shí)，如培養(yǎng)物仍無(wú)菌生長(zhǎng)，則可判為陰性。

肛試子及其他環(huán)境標(biāo)本的處理：將現(xiàn)場(chǎng)采集已接種標(biāo)本的分離平板和增菌液直接放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。取出18~24小時(shí)培養(yǎng)的增菌液轉(zhuǎn)種XLD瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板。將接種完畢的平板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。

菌株分離與鑒定

主要實(shí)驗(yàn)試劑有：氧化酶（試劑）、三糖鐵（TSI）、動(dòng)力—靛基質(zhì)—尿素半固體（MIU）和賴氨酸鐵瓊脂斜面、API20E、沙門菌診斷血清。

沙門菌菌株的鑒定主要試驗(yàn)有：菌體形態(tài)觀察，菌落形態(tài)觀察，氧化酶實(shí)驗(yàn)，初步生化鑒定（系統(tǒng)生化鑒定），血清學(xué)分型。

菌落形態(tài)觀察：在XLD平板上沙門菌菌落呈粉紅色、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、產(chǎn)H2S的菌株，可形成中心黑色或全部黑色的菌落。在BS瓊脂平板上，沙門菌菌落呈黑色有金屬光澤、棕色或灰色，培養(yǎng)基周圍可呈現(xiàn)黑色或棕色，有些菌株可形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。在麥康凱瓊脂平板上，沙門菌菌落為無(wú)色、透明或半透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、圓形。從分離平板上挑取3-5個(gè)可以菌落，分別接種XLD平板和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將接種完畢的平板置37℃培養(yǎng)箱中，18~24小時(shí)純化培養(yǎng)。

菌體形態(tài)觀察：挑取純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。沙門菌為革蘭陰性桿菌，長(zhǎng)1-3um，寬0.5~1um，無(wú)芽胞，兩端鈍圓。

氧化酶試驗(yàn)：用一次性接種環(huán)（或牙簽）挑取菌落于濾紙上，滴加氧化酶試劑一滴，在10s內(nèi)菌落不變色為陰性，呈現(xiàn)紫色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)菌落不變色，氧化酶試驗(yàn)為陰性：

初步生化鑒定：將菌落形態(tài)和氧化酶試驗(yàn)符合沙門菌特征的純培養(yǎng)物分別接種于三糖鐵瓊脂斜面（TSI）、MIU培養(yǎng)基、賴氨酸鐵瓊脂斜面，將已接種的生化培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。

典型的沙門菌在三糖鐵（TSI）上，斜面呈紅色，下層產(chǎn)酸呈黃色，多數(shù)沙門菌產(chǎn)生硫化氫，試管內(nèi)出現(xiàn)黑色，有氣泡。

賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性，培養(yǎng)基由紫色變成紫黑色。

在MIU培養(yǎng)基上尿素為陰性培養(yǎng)基不變色，有動(dòng)力，沿穿刺線渾濁生長(zhǎng)，加入靛基質(zhì)試劑0.5ml于試管內(nèi)，輕搖試管，沙門菌靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果不定。本試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)為陰性，試劑不變色。

系統(tǒng)生化鑒定：腸桿菌科細(xì)菌在生化反應(yīng)上有類似之處，對(duì)初步生化試驗(yàn)符合沙門菌的可疑菌株需要進(jìn)一步做系統(tǒng)的生化鑒定。生化試劑可采用自配或市售成品，也可選用生化鑒定試劑盒（API 20E）或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK）。本試驗(yàn)以API 20E生化鑒定試劑盒進(jìn)行示范，具體操作步驟如下：

菌懸液制備：挑取24小時(shí)培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上1~2個(gè)菌落至5ml滅菌生理鹽水中制成均勻的菌懸液。

接種與培養(yǎng)：將配制好的菌懸液按產(chǎn)品說(shuō)明書要求填充API 20E條上的小杯，按要求加蓋礦物油，置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)，待觀察。

結(jié)果觀察與判定：按照說(shuō)明書要求，在讀取結(jié)果前，部分試驗(yàn)先添加附加試劑。根據(jù)API 20E中的讀數(shù)表判定和記錄各項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果，并得到一個(gè)7位數(shù)的編碼，通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)或API編碼表中查詢?cè)摼幋a即可獲得菌株鑒定結(jié)果。

血清學(xué)分型：對(duì)生化鑒定為沙門菌的菌株，需用玻片凝集法進(jìn)行血清學(xué)分型，血清學(xué)分型試驗(yàn)的主要步驟為：先用A-F多價(jià)血清作玻片凝集，若血清發(fā)生凝集再分別選用O4 O9 O2 O10 O7等因子血清做玻片凝集，以判定其群別。根據(jù)判定的O抗原，進(jìn)行H抗原的第一相和第二相抗原凝集和判定，下面以某品牌血清為例進(jìn)行試驗(yàn)。

第一步，O抗原凝集，分別取一環(huán)A~F血清和生理鹽水于潔凈的載玻片上，挑取待檢菌株新鮮培養(yǎng)物適量，研成乳狀，傾斜搖動(dòng)玻片1分鐘，觀察血清凝集情況。若血清產(chǎn)生凝集顆粒鹽水無(wú)顆粒者判為陽(yáng)性；兩者均無(wú)凝集顆粒產(chǎn)生，判為陰性；鹽水有顆粒者為粗糙型菌株，不能分型。本菌株結(jié)果為陽(yáng)性。

第二步，取一環(huán)O4血清于潔凈的載玻片上，用與上述相同的方法試驗(yàn)，結(jié)果若為陽(yáng)性，進(jìn)行H因子血清凝集試驗(yàn)；若結(jié)果為陰性，再分別選用O9 O2 O10 O7等因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。本菌株O4為陽(yáng)性。

第三步，H抗原凝集，在沙門菌抗原表中，選擇與O4相對(duì)應(yīng)的H因子的第一相和第二相單因子血清作逐一凝集試驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果被檢沙門菌的抗原式為1,4,5，12：i：1,2 為鼠傷寒沙門菌。

血清凝集試驗(yàn)中幾種特殊情況：

1.Vi抗原的判定：傷寒或丙型副傷寒沙門菌的Vi抗原能阻礙O抗原凝集，含豐富Vi抗原的傷寒菌株，經(jīng)煮沸破壞Vi抗原，再與O血清凝集。實(shí)驗(yàn)方法為，取適量菌苔于1ml生理鹽水中，在酒精燈火焰上煮沸后再與O血清凝集，若仍不凝集，可送上級(jí)單位鑒定。2.位相誘導(dǎo)法試驗(yàn)：如雙相菌只檢出一相H抗原時(shí)，可用位相誘導(dǎo)的方法獲得另一相抗原。位相誘導(dǎo)方法較多，主要有，小玻璃管法、小倒管法、簡(jiǎn)易平板法。本篇著重介紹簡(jiǎn)易平板法。將0.7%~0.8%半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取已知相因子血清一環(huán)滴在半固體瓊脂平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央 點(diǎn)接種待檢菌株，36℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后，在形成蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣取菌做凝集試驗(yàn)。

3.H抗原不凝集：如果兩相H抗原均不出現(xiàn)，則應(yīng)通過(guò)半固體瓊脂平板、血平板等瓊脂平板傳代法獲得某相或兩相抗原

PCR檢驗(yàn)

在沙門菌的檢測(cè)工作中，常利用PCR技術(shù)來(lái)做沙門菌檢測(cè)的初篩實(shí)驗(yàn)，以提高工作效率，降低成本。PCR初篩試驗(yàn)采用檢測(cè)樣品增菌液中是否有沙門菌屬侵襲性抗原保守基因（invA 基因）的存在，以此來(lái)判定是否有沙門菌的存在。PCR反應(yīng)條件，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)72℃延伸7min。

用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果時(shí)，如在284bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則為陽(yáng)性，凡是PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)本，均應(yīng)進(jìn)行沙門菌病原菌的檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

在沙門菌檢驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下問(wèn)題。

1.試驗(yàn)應(yīng)在BSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室的二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行操作，并做好個(gè)人的安全防護(hù)工作。

2.在生化初篩試驗(yàn)中應(yīng)特別注意，只有在三糖鐵瓊脂斜面和底層均產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性的菌株或尿素酶陽(yáng)性的菌株可以排除，其他的反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)確證。

3.沙門菌的鑒定和血清學(xué)分型試驗(yàn)必須使用純化菌株。

4.BS瓊脂平板要求的培養(yǎng)觀察時(shí)間為48小時(shí)，此時(shí)才能形成描述的典型菌落。