附件9

食品中硼酸的快速檢測(cè)

姜黃素比色法

（KJ201909）

范圍

本方法規(guī)定了食品中硼酸的姜黃素比色快速檢測(cè)方法。

本方法適用于糧食制品、淀粉及淀粉制品、糕點(diǎn)、豆制品、速凍食品（速凍面米食品、肉丸、蔬菜丸）中硼酸的快速測(cè)定。

原理

本方法采用姜黃素比色法的原理，通過超聲輔助用水提取樣品中硼酸，用乙基己二醇-三氯甲烷溶液對(duì)樣品中的硼酸進(jìn)行快速的富集、萃取，利用硫酸與姜黃素混合生成的質(zhì)子化姜黃與硼酸反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物。溶液顏色的深淺與樣品中硼酸的含量成正相關(guān)，通過色階卡進(jìn)行目視比色，確定樣品中硼酸的含量。

試劑與材料

除另有規(guī)定外，本方法所用的試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1

試劑

3.1.1

硫酸。

3.1.2

無水乙醇。

3.1.3

亞鐵氰化鉀。

3.1.4

乙酸鋅。

3.1.5

姜黃素（CAS:458-37-7），純度≥

99%。

3.1.6

冰乙酸。

3.1.7

2-乙基-1,3-己二醇（色譜純）。

3.1.8

三氯甲烷（色譜純）。

3.1.9

硫酸溶液（1+1）：取等體積的硫酸（3.1.1）與水，將硫酸緩慢加入到水中，并用玻璃棒不斷的攪拌，待冷卻后裝入塑料容器中。

3.1.10

亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6

g亞鐵氰化鉀（3.1.3），用水溶解并稀釋至100

mL。

3.1.11

乙酸鋅溶液：稱取22.0

g乙酸鋅（3.1.4），用水溶解并稀釋至100

mL。

3.1.12

2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液(EHD-CHCl3溶液)：稱取2-乙基-1,3-己二醇(3.1.7)

10.6g，用三氯甲烷(3.1.8)溶解并稀釋至100

mL，此溶液保存于塑料容器中。

3.1.13

姜黃-冰乙酸溶液：稱取姜黃素(3.1.5)40

mg，溶于100

mL冰乙酸(3.1.6)中，此溶液保存于塑料容器中，該溶液需臨用新制。

3.2

參考物質(zhì)

硼酸參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見表1。

表1

硼酸參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量

中午名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對(duì)分子質(zhì)量

硼酸

Boric

Acid

10043-35-3

H3BO3

61.8

3.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.3.1

硼酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000

μg/mL）：準(zhǔn)確稱取在硫酸干燥器中干燥5

h以上的硼酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解并配制成1000

μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于塑料容器中。

3.3.2

硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100

μg/mL）：取硼酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.0

mL，加水定容至100

mL，保存于塑料容器中。所配制溶液于0℃～4℃冰箱中可儲(chǔ)存3個(gè)月。

3.4

材料

硼酸快速檢測(cè)試劑盒，需在陰涼、干燥、避光條件下保存。

儀器與設(shè)備

4.1

電子天平：感量為0.01

g。

4.2

樣品搗碎機(jī)。

4.3

超聲儀。

4.4

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000

r/min。

4.5

氮?dú)獯蹈蓛x或空氣吹干儀：溫度控制≥60℃。

4.6

渦旋振蕩器。

4.7

移液器：200

μL、1

mL、10

mL。

分析步驟

5.1

試樣的制備

取適量樣品，充分粉碎混勻。

5.2

試樣的提取

準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣2

g（精確至0.1

g），置于50

mL離心管中，準(zhǔn)確加水7

mL，加入硫酸溶液（3.1.9）2

mL，渦旋振蕩提取1min后超聲提取15

min，期間振搖2～3次，加入0.5mL亞鐵氰化鉀溶液（3.1.10）與0.5

mL乙酸鋅溶液（3.1.11），混勻后于4000

r/min離心5

min(若離心效果不佳，可適當(dāng)提高離心轉(zhuǎn)速)，準(zhǔn)確吸取1.0

mL上清液于2.0

mL離心管中，向離心管中加入EHD-CHCl3溶液（3.1.12）0.5

mL，上下顛倒振搖15～20次，靜置分層（若有乳化現(xiàn)象，可低速離心），將上層溶液去除干凈，取下層液體100

μL于2.0

mL離心管中，加入400

μL姜黃素-冰乙酸溶液（3.1.13），再加入20

μL硫酸溶液（3.1.9），于60℃～70℃水浴中氮?dú)猓ɑ蚩諝猓┐抵两?，加?

mL無水乙醇，振搖使殘?jiān)咳芙?，為待測(cè)液。

注：粉絲、粉條等干基樣品加入水和硫酸溶液后需浸泡15

min，再進(jìn)行后續(xù)處理。

5.3

測(cè)定步驟

將待測(cè)液與標(biāo)準(zhǔn)色階卡目視比色，15

min內(nèi)判讀結(jié)果。需進(jìn)行平行試驗(yàn)，兩次測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致，即顯色結(jié)果無肉眼可辨識(shí)差異。

注：整個(gè)試驗(yàn)避免在陽光直射的地方操作。

5.4

質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和質(zhì)控樣品試驗(yàn)（或加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)）。用色階卡和質(zhì)控試驗(yàn)同時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行控制。

5.4.1

空白試驗(yàn)

稱取空白樣品，按照5.1～5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

質(zhì)控樣品試驗(yàn)（或加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)）

5.4.2.1

質(zhì)控樣品

硼酸質(zhì)控樣品：采用典型樣品基質(zhì)或相似樣品基質(zhì)模擬實(shí)際生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，含有一定量硼酸(可考慮基質(zhì)本底最大可能硼酸量)，并可穩(wěn)定保存的樣品。樣品需經(jīng)參比方法確認(rèn)質(zhì)控樣品中硼酸的含量。

5.4.2.2

加標(biāo)質(zhì)控樣品

硼酸加標(biāo)質(zhì)控樣品：準(zhǔn)確稱取空白試樣2

g（精確至0.1

g），加入適量硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000

μg/mL

或100

μg/mL）（3.3），使在不同基質(zhì)樣品中硼酸含量與5.4.2.1相同。

質(zhì)控樣品（或加標(biāo)質(zhì)控樣品）按5.1和5.2步驟與樣品同法操作。

結(jié)果判定要求

觀察待測(cè)液的顏色，與標(biāo)準(zhǔn)色階卡比較判讀樣品中硼酸的含量。顏色淺于檢測(cè)限（2.5

mg/kg）則為陰性樣品；顏色深于檢測(cè)限的根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行判讀。色階卡見圖1。

圖1

硼酸色階卡

質(zhì)控試驗(yàn)要求：空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，質(zhì)控樣品試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)在其標(biāo)示量值允差范圍內(nèi)，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)與加標(biāo)量相符。

結(jié)論

由于色階卡目視判讀存在一定誤差，為盡量避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，讀數(shù)時(shí)遵循就高不就低的原則。

性能指標(biāo)

8.1

檢測(cè)限

2.5mg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應(yīng)≥99%。

8.3

特異性

特異性應(yīng)≥85%。

8.4

假陰性率

假陰性率應(yīng)≤1%。

8.5

假陽性率

假陽性率應(yīng)≤15%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。

其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不作限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。色階卡應(yīng)確保在試劑盒保質(zhì)期內(nèi)不出現(xiàn)褪色或變色的情況。

若檢測(cè)結(jié)果大于檢測(cè)限，需對(duì)其進(jìn)行研判，并采用參比方法確證。

本方法的參比方法為GB

5009.275-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中硼酸的測(cè)定》。

附錄A

快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表

表A.1

性能指標(biāo)計(jì)算方法

樣品情況a

檢測(cè)結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N12

N.2=N21+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異(х2)

c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對(duì)準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。用于確認(rèn)方法時(shí)，結(jié)果≥2.5mg/kg時(shí)，判定為陽性（僅用于計(jì)算性能指標(biāo)）；

c本方法規(guī)定：用于計(jì)算靈敏度和假陰性率的陽性樣品，由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果范圍應(yīng)在2.5～10mg/kg之間。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

d為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院

驗(yàn)證單位：江南大學(xué)、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院、湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院

本方法的主要起草人為：李濤

林芳

袁磊

喬蓉霞

孫秀蘭

王一欣

周陶鴻