第一篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

微 生 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告（格式標(biāo)準(zhǔn)）

(生命科學(xué)專業(yè))

教 師：黎 勇

目錄索引

實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法 3

實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色 5

實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制 7

實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別 8

實(shí)驗(yàn)

五、微生物大小的測(cè)定與顯微計(jì)數(shù) 10

實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化 11

實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng) 12

實(shí)驗(yàn)八（綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 13

課程名稱： 微生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)班級(jí)：化生系生命科學(xué)本科

實(shí)驗(yàn)日期：

指導(dǎo)教師：黎勇 實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法

〔目的要求〕學(xué)習(xí)并熟練掌握油鏡的使用技術(shù)；觀察細(xì)菌的基本形態(tài)；學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性的基本方法。

〔基本原理〕

1.N2A=n2sinα

2.D=λ/2N.A

3.目鏡可提高放大倍數(shù)，但有效放大率取決于鏡口率。已經(jīng)分辨的物體不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4.用懸滴法或凹玻片法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性時(shí)，可以通過(guò)真運(yùn)動(dòng)能定向地由一處快速運(yùn)動(dòng)來(lái)區(qū)別于顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)。

〔器材用具〕顯微鏡、載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水紙、擦鏡紙；細(xì)菌、放線菌等固定裝片；培養(yǎng)18小時(shí)左右的B.subtilis.S.arueus菌斜面培養(yǎng)物；無(wú)菌水、生理鹽水。

〔方法步驟〕：

（一）油鏡的使用

鏡檢裝片在中倍（或高倍鏡）下找到目的物，并使位于視野正中

聚光鏡上升到最高位置，虹彩光圈開到最大，鏡頭轉(zhuǎn)開成八字形

在玻片的鏡檢部位（光斑處）滴一滴香柏油

油鏡轉(zhuǎn)入正下方

側(cè)視小心上升載物臺(tái)（縮短鏡頭與裝片距離，鏡頭浸入油中，至油圈不擴(kuò)大為止鏡頭幾與裝片接觸）粗調(diào)器徐徐下降載物臺(tái)（密切注視視野，當(dāng)捕捉到物像時(shí)，立即用細(xì)調(diào)器校正）仔細(xì)觀察并繪圖

取出裝片，清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油

擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留（用手指輔助，迅速拭擦一、二次）

用清潔擦鏡紙仔細(xì)擦干二甲苯（2-3次）。

（二）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法：涂片

干燥

火焰固定

染色

水洗

干燥

油鏡觀察

（三）細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察 取潔凈蓋玻片，四周涂上凡士林

滴加一小滴菌懸液

凹玻片的凹窩向下蓋于蓋玻片上

翻轉(zhuǎn)觀察

〔結(jié)果分析〕

1、畫一圓圈表示視野，選取所觀察的微生物繪圖，注意特殊結(jié)構(gòu)、形狀和排列。（描繪時(shí)按視野實(shí)際大小5－10倍繪制）

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：無(wú) 特殊結(jié)構(gòu)：無(wú)

視野觀察下微生物的形態(tài)

2、油鏡使用時(shí)為什么必須干燥裝片？

防止水油分層，光受到折射而影響油鏡性能的發(fā)揮

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

首次實(shí)驗(yàn)中有幾個(gè)要點(diǎn)：一是按無(wú)菌操作取用菌；二是涂片技術(shù)的掌握；三是油鏡使用技術(shù)。凡實(shí)驗(yàn)中學(xué)生的所思所想，如無(wú)菌操作技術(shù)要點(diǎn)、自行處理實(shí)驗(yàn)材料、失敗與思考等均可進(jìn)行討論（如涂片時(shí)蒸餾水不宜過(guò)多、取用菌時(shí)防止菌被灼燙變形、取菌宜少不宜多等均是可以討論的內(nèi)容）。

實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色

〔目的要求〕觀察細(xì)菌菌落的特征；掌握簡(jiǎn)單染色法、革蘭氏染色法的原理及操作步驟；在油鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體形態(tài)；學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對(duì)微生物分布廣泛性的認(rèn)識(shí)

〔器材用具〕E.coliB.subtilisS.aureus.的斜面培養(yǎng)物（18－24小時(shí)）以及菌落平板各一個(gè)；染液：草酸銨結(jié)晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無(wú)菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、、擦鏡紙、接種環(huán)。

〔方法內(nèi)容〕：

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中微生物的檢查

（二）革蘭氏染色法 涂片固定

冷卻

結(jié)晶紫染色1min 水洗

碘媒染1min 95%乙醇30-60s 水洗

番紅復(fù)染2－3min

水洗

干燥

油鏡鏡檢

（三）芽孢染色 涂片固定

孔雀綠加熱染色（勿干）5min 水洗

番紅復(fù)染1min

水洗

鏡檢

〔結(jié)果分析〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果被染成紫色者即為革蘭氏陽(yáng)性，被染成紅色者為革蘭氏陰性；菌體染成紅色，芽孢被染成綠色。

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

染色反應(yīng)：紅色（陰性）染色反應(yīng)：紫色（陽(yáng)性）

菌名：枯草芽孢桿菌

放大倍數(shù)：100310（35）

染色反應(yīng)：紫色（陽(yáng)性）

圖1 視野觀察下細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)

圖2 枯草芽孢桿菌芽孢形態(tài)圖

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

嚴(yán)格掌握脫色程度，是成敗的關(guān)鍵。若脫色時(shí)間過(guò)度，則陽(yáng)性菌初時(shí)之紫色脫出，復(fù)染成紅色，誤成陰性，反之脫色時(shí)間不足，陰性菌在初染時(shí)的紫色未能脫出，復(fù)染時(shí)不能染成紅色，誤以為陽(yáng)性菌；涂片不能厚；盧弋氏碘即用即配。

作業(yè)

1、繪出所觀察到到細(xì)菌的視野圖，并說(shuō)明染色反應(yīng)。

2、哪些因素會(huì)影響到革蘭氏染色結(jié)果的正確？其中是關(guān)鍵的一步是什么？ 菌齡及培養(yǎng)條件和染色技術(shù)是最主要的，關(guān)鍵是脫色。

3、怎樣對(duì)未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，以證明你的結(jié)果的正確？

與已知菌混合涂片比較。

實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制

〔目的要求〕了解培養(yǎng)基的配制原理；了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序；了解培養(yǎng)基過(guò)程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項(xiàng)。了解半合成培養(yǎng)基的配制原理，學(xué)習(xí)掌握肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基的配制方法。

〔器材用具〕等配各種培養(yǎng)基的組成成分，瓊脂、1N NaoH溶液 1N HCl天平或臺(tái)秤高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報(bào)紙等。

〔方法步驟〕

(一)玻璃器皿的洗滌和包裝 以小組為單位清洗、控水，按9個(gè)為一組，分別用報(bào)紙包好并放入烘箱中等待滅菌。

(二)液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程

原料稱量（按配方次序）

溶解

調(diào)節(jié)ｐH 過(guò)濾澄清

分裝

塞棉塞和包札

滅菌

分別按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯液體及固體培養(yǎng)基。

(三)培養(yǎng)基的分裝 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置

選用153150平口試管或150mL錐形瓶貼上標(biāo)簽

分裝（至試管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固體用1/3）

要求：每人制作斜面3支。其余分裝至錐形瓶中。

(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 分別制作試管及錐形瓶棉塞并塞好好以牛皮紙包裝頭部。

(五)培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基用濕熱法滅菌；皿用干熱法分別滅菌。

(六)斜面和平板的制作（下次試驗(yàn)完成）

(七)培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查（下次實(shí)驗(yàn)完成）

(八)無(wú)菌水的制備 同時(shí)制作無(wú)菌生理鹽水，置錐形瓶中備用。

〔結(jié)果分析〕

以斜面接種培養(yǎng)驗(yàn)證培養(yǎng)基配制效果；

以平板制作及接種24小時(shí)培養(yǎng)驗(yàn)證滅菌效果；

簡(jiǎn)述移液管包裝的注意事項(xiàng)。

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

滅菌器的滅菌效果必須間隔一段時(shí)間，加以驗(yàn)證，主要方法除無(wú)菌檢查外，還通過(guò)壓力試紙同時(shí)滅菌來(lái)驗(yàn)證其壓力與溫度；培養(yǎng)基通常成批制作備用。但制作后，其貯藏時(shí)間有一定限制，一般室溫條件下不超過(guò)三周；冰箱4℃條件下可貯藏半年，過(guò)期不能用。

作業(yè)：

1、記錄培養(yǎng)基的成分和名稱

2、分析所配制培養(yǎng)基的碳源、氮源、能源及無(wú)機(jī)鹽、維生素的來(lái)源。所配制均為天然培養(yǎng)基，各成分主要來(lái)自有機(jī)質(zhì)，微量元素可以由自來(lái)水提供。

3、什么是天然培養(yǎng)基？什么是半合成、合成培養(yǎng)基？

實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別

〔目的要求〕觀察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、個(gè)體形態(tài)、生長(zhǎng)及繁殖方式。學(xué)習(xí)酵母死活細(xì)胞的鑒別方法。

〔材料用具〕釀酒酵母、紅酵母、假絲酵母；(釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個(gè)。釀酒酵母豆芽汁斜面及釀酒酵母醋酸鈉斜面各一支，假絲酵母加蓋片培養(yǎng)的平板)；7.6%孔雀綠染液，0.5%蕃紅染液，蘇丹黑染液，二甲苯，中性紅染液，碘液；目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺；載片及蓋片。

〔方法步驟〕

(一)菌落特征的觀察

(二)個(gè)體形態(tài)與出芽

(三)子囊孢子的觀察

(四)酵母死活細(xì)胞的觀察。

〔結(jié)果分析〕描述釀酒酵母霉菌的菌落形態(tài)特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細(xì)胞細(xì)節(jié)；

（一）酵母的菌落濕潤(rùn)，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；

菌名：釀酒酵母

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：芽（出芽繁殖）

（二）霉菌

菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

（如右圖）

菌名：青霉（Penicillium）

菌名：毛霉（Circinella）

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：分生孢子梗（帚狀分枝）

特殊結(jié)構(gòu)：孢子囊

菌名：曲霉（Aspergillus）

菌名：根霉（Rhizopus）

放大倍數(shù)：模式圖

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：足細(xì)胞 特殊結(jié)構(gòu)：假根

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

作業(yè)：

1、繪圖說(shuō)明所觀察到的酵母菌、霉菌的形態(tài)特征。

實(shí)驗(yàn)

五、微生物大小的測(cè)定與顯微計(jì)數(shù)

〔目的要求〕學(xué)習(xí)并掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物細(xì)胞大小的方法；了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理，掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

〔材料用具〕啤酒酵母；顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺；血球計(jì)數(shù)板；蓋玻片，載玻片，滴管，試管，無(wú)菌水，〔方法步驟〕

(一)酵母細(xì)胞大小測(cè)定

(1)目鏡測(cè)微尺的校正(2)細(xì)胞大小的測(cè)定

(二)顯微計(jì)數(shù)法

(1)鏡檢計(jì)數(shù)室

(2)菌懸液制備及加樣

(3)計(jì)數(shù)

(4)清洗計(jì)數(shù)板

〔結(jié)果分析〕結(jié)果記錄入表中。

1、目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定結(jié)果（精確到零點(diǎn)幾小格）物鏡倍數(shù)

（目鏡均為10倍）目鏡測(cè)微尺的格數(shù)（小格）

鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)（小格）

目鏡測(cè)微尺的每格的長(zhǎng)度（μm）40倍

2、酵母菌大小測(cè)定結(jié)果 菌號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目鏡測(cè)微尺的格數(shù)（小格）長(zhǎng)軸

短軸

酵母大小平均值＝±（保留小數(shù)點(diǎn)后2位）

長(zhǎng)軸＝

3、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 各中格中菌數(shù) 總菌數(shù) 稀釋倍數(shù)平均值

菌數(shù)(個(gè)/mL)1

短軸＝

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

作業(yè)：

1.什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺校正。2..根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)說(shuō)明血細(xì)胞計(jì)數(shù)法的誤差主要來(lái)自哪些方面？如何減少誤差？ 3..在滴加菌液時(shí)，為什么要先置蓋玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置蓋玻片？ 4..用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量時(shí)，哪些步驟易造成誤差？如何預(yù)防？計(jì)算細(xì)胞數(shù)目時(shí)此法是否可以適用？ 實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化 〔目的要求〕

1、學(xué)習(xí)并掌握各種無(wú)菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物的劃線分離接種

2、學(xué)習(xí)掌握平板菌落計(jì)數(shù)法 〔基本原理〕

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是生物多樣性的重要場(chǎng)所，也是發(fā)揚(yáng)微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多的菌株。劃線法是常用的分離與純化方法，通過(guò)無(wú)菌操作條件下，“漸劃漸稀”的效應(yīng)而得到菌落純的菌株。

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散形成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌量。這種方法為活菌計(jì)數(shù)法，廣泛應(yīng)用于生物制品及污染程度（含菌指數(shù)）的檢測(cè)。

〔材料與用品〕

土樣10g，無(wú)菌平皿（20套）及無(wú)菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；無(wú)菌有帽試管，三角瓶，無(wú)菌涂棒，接種環(huán)，記號(hào)筆，酒精燈，火柴，試管架 〔方法步驟〕

1、周圍環(huán)境中微生物的檢測(cè)

平板分4個(gè)區(qū)做好標(biāo)記

用未洗的手指及肥皂洗過(guò)的手指（1次、2次、3次，或其它）分別在四個(gè)區(qū)上涂抹

倒置到37℃培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。

2、土壤中微生物分離純化及平板計(jì)數(shù)

采土樣（5－20cm）土10g，裝入到已滅菌的牛皮袋（信封）中，封好袋口

1.0g加入99mL無(wú)菌水（三角瓶）中

1mL無(wú)菌吸管0.5mL加入到4.5mL無(wú)菌水試管中，吹吸三次，振蕩均勻(10-3)。同法得10－4－10－6土壤溶液

用接種環(huán)沾取10-2土壤懸液在已經(jīng)凝固的平板表面進(jìn)行劃線分離

分別取各濃度土壤懸液0.1mL對(duì)號(hào)均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨平板，用無(wú)菌涂棒涂勻（多涂幾遍）。每個(gè)濃度做3個(gè)平板。〔結(jié)果分析〕

1、有較大片菌苔生長(zhǎng)時(shí)，棄用。

2、選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的平板。只有一個(gè)濃度符合此范圍時(shí)，以該平均菌落數(shù)為準(zhǔn)；有兩個(gè)濃度的平板菌落數(shù)在30－300之間時(shí)，按兩者的總數(shù)平均決定，比值小于2，取平均，比值大于2則取較少的菌落總數(shù)。所有菌落數(shù)大于300，取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)；所有菌落數(shù)均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)（即當(dāng)所有菌落數(shù)均不在30－300之間時(shí)，此實(shí)驗(yàn)的精確度要求下，可以最接近30或300的菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)）。

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

土壤中的菌數(shù)量在哪個(gè)數(shù)量級(jí)？你分離的微生物主要有哪些種類？為什么？

105數(shù)量級(jí)，主要是細(xì)菌，也有酵母。主要通過(guò)其菌落特征來(lái)判斷。細(xì)菌的菌落為濕潤(rùn)，其正反面顏色一般一致，普遍比較小。酵母的菌落濕潤(rùn)，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)

〔目的要求〕了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)方法；通過(guò)對(duì)不同細(xì)菌對(duì)不同含碳、氮化合物的分解利用情況，了解基代謝多樣性；學(xué)習(xí)不同培養(yǎng)基基中的不同生長(zhǎng)現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。

〔實(shí)驗(yàn)原理〕各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物存在差別。細(xì)菌的這種代謝方式可供鑒別細(xì)菌之用。用生理生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。有些細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體；有的細(xì)菌則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。在配制培養(yǎng)基時(shí)預(yù)先加入溴甲酚紫（ｐH4.4紅色～ｐH6.2黃色），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，培養(yǎng)基由紫色變黃，氣體的產(chǎn)生則可由試管中倒置的杜氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)判斷。大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇，V.P.試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性。產(chǎn)氣桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵，V.P試驗(yàn)為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。

〔材料用具〕E.coli，變形桿菌，枯草芽孢桿菌，產(chǎn)氣桿菌，糞水中分離的未知菌種斜面，糖發(fā)酵培養(yǎng)基；超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，試管，移液管，杜氏小管。甲基紅試劑、V.P.試劑。

〔實(shí)驗(yàn)步驟〕各取4支相應(yīng)的培養(yǎng)基，標(biāo)記好發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱、所接菌種名及組號(hào)，1支接大腸桿菌，1支接變形桿菌，1支接未知斜面菌種，1支不接。

1、糖發(fā)酵試驗(yàn)

2、甲基紅試驗(yàn)

3、V.P.試驗(yàn)

接種后37℃分別培養(yǎng)24h、48h、48h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表中?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕

表7－1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 編號(hào) 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 產(chǎn)氣桿菌 未知菌 CK 葡萄糖發(fā)酵

乳糖發(fā)酵

甲基紅實(shí)驗(yàn)

V.P.試驗(yàn)

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

如：討論通過(guò)哪些生理生化反應(yīng)可以區(qū)分大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌？

大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇，V.P.試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性。產(chǎn)氣桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵，V.P試驗(yàn)為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。

實(shí)驗(yàn)八（綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 [目的要求]

1．掌握細(xì)菌、放線菌、酵母苗和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。

2．學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。

3．學(xué)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。

4．學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)法。[基本原理]

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥，偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線苗數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；白面曲(發(fā)面用的引子)或酒曲或果園土中分離酵母菌。

為了分離和確保獲得某種微生物的單苗落，首先要考慮制備不同稀釋度的苗懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時(shí)的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾。細(xì)菌或放線苗在中性或微堿性環(huán)境較多．但細(xì)菌比放線萌生長(zhǎng)快，分離放線菌時(shí)，一般在制備土壤稀釋液時(shí)添加10%酚或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細(xì)菌和霉菌(如加鏈霉素25-50μg mL以抑制細(xì)菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌靈30μ／mL以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時(shí)生長(zhǎng)極快。而細(xì)菌生長(zhǎng)適宜的酸堿度為pH7，所以分離酵母菌時(shí)只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH，可降低細(xì)菌增殖率，霉菌生長(zhǎng)慢，也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌，需降低細(xì)菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過(guò)菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計(jì)數(shù)，分離霉菌時(shí)常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長(zhǎng)繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間見表所示。[材料與用品] 1.菌源 選定采土地點(diǎn)舌。鏟去表土層2～3cm，取3～10cm深層土壤10g，裝入已滅過(guò)菌的牛皮紙袋內(nèi)．封好袋口，并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時(shí)分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵母菌。也可用酒曲等替代。

2．培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基(制平板和斜面，3．無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水 配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝99mL(或95mL分離霉菌用)，每瓶?jī)?nèi)裝10粒玻璃珠；分裝試管，每管裝約4.5-5mL(不超過(guò)試管高度的1／5)。

4．其他試劑與用品 無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌移液管、無(wú)菌玻璃涂棒(刮刀)、稱量紙、藥匙、洗耳球、10％酚溶液。[實(shí)驗(yàn)步驟]

1．稀釋分離法平板分離菌有傾注法和涂布法兩種。本次實(shí)驗(yàn)分離細(xì)菌、放線菌、霉菌時(shí)采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法：

(1)細(xì)菌的分離 1)制備土壤稀釋液 稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10一20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離，以制備10-2稀釋度為例，具體操作過(guò)程如下：取4.5 mL無(wú)菌水試管6支，按10-2......10-7順序編號(hào)，放置在試管架上。取無(wú)菌移液管一支，從移液管包裝紙?zhí)?中間撕口，將包裝紙?zhí)追殖缮稀⑾聝啥?，去除下段包裝紙?zhí)祝谝埔汗苌隙斯芸谘b橡皮頭，取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂妫杂沂帜粗?、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過(guò)火焰2～3次，殺滅撕紙?zhí)讜r(shí)可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無(wú)名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夾在于上，不能亂放在桌上)，將lmL移液管的吸液端伸進(jìn)振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶?jī)?nèi)反復(fù)吹吸二次(吹吸時(shí)注意第二次液面要高于第一次吹吸 的液面)，然后準(zhǔn)確吸取0.5mL10-2土壤稀釋液，右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5mL無(wú)菌水的試管，依前法在火焰旁拔除試管帽(或棉塞)，將0.5m10-2土壤稀釋液注入4.5m1無(wú)菌水試管內(nèi)，制成l0-3的土壤稀 釋液，將此移液管通過(guò)火焰再插入原來(lái)包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。另取一只未用過(guò)的無(wú)菌移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次，然后取出移液管，并將其通過(guò)火焰再插入原來(lái)包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20～30次。混勻土壤稀釋液。再?gòu)募執(zhí)兹〕鲈瓉?lái)的移液管，插入稀釋液已搖勻的試管內(nèi)，再吹吸三次，然后準(zhǔn)確吸出o.5mL 10-3的稀釋液。置第二支裝有4.5 m1無(wú)菌水試管，制成10-4：土壤稀釋液。用同法再制成 10-

5、10-

6、10一7的土壤稀釋液(為避免稀釋過(guò)程誤差，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時(shí)，最好每一個(gè)稀釋度更換一支移液管)：最后用的移液管重新放人紙?zhí)變?nèi)。待滅菌后，再洗刷或?qū)⒂眠^(guò)的移液管放在廢棄物筒中．用3%-5%來(lái)蘇爾浸泡l h后再滅菌洗滌。2)傾注法分離 取無(wú)菌培養(yǎng)皿6-9套，分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號(hào)。稀釋完畢后，用原來(lái)的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1mL稀釋液，按無(wú)菌操作技術(shù)加到和應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再依同方法分別吸取1mLl0-

6、10-5的土壤稀釋液，各加到和應(yīng)編號(hào)為10-

6、10-5的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化，待冷卻至45-50度左右，分別傾入到已盛有I0-

5、10-

6、10-7土壤稀釋液的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：溫度過(guò)高易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會(huì)影響分離效果；低于45％培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。傾倒培養(yǎng)基時(shí)注意無(wú)菌操作，要在火焰旁進(jìn)行。左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶底部，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞拔開，灼燒瓶口．用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約12-15 mL，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻．混勻后靜置桌上，待凝。3)培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35-37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。

(2)放線菌的分離

1)制備土壤稀釋液 稱取土樣l g，加入盛有99m1并裝有玻璃珠的無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水錐形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，可用l％的重鉻酸鉀溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振蕩后靜置5min，即成10-2土壤稀釋液。

2)傾注法分離 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-

3、10-

4、10-5三個(gè)稀釋度，然后用無(wú)菌移液管依次分別吸取lmL 10-

5、l0-

4、10-3土壤稀釋液于對(duì)應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基依前法傾倒平板，每個(gè)稀釋度做2～3個(gè)平行培養(yǎng)皿。理鹽水內(nèi)，振蕩20min，即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園上樣，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。3)涂布法分離 依前法向無(wú)菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無(wú)菌移液管分別吸取上述l0-

6、l0-

5、10-4三個(gè)稀釋度苗懸液0.1mL，依次滴加于對(duì)應(yīng)編號(hào)已制備好的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無(wú)菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過(guò)猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。4)培養(yǎng) 接種后，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d觀察結(jié)果。

2劃線分離法 菌種被其他雜苗污染時(shí)或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。此法將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個(gè)微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。平板制作方法如前所述。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。(1)連續(xù)劃線法 連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。以無(wú)菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過(guò)稍打開皿蓋的縫隙伸人平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻．然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時(shí)平板面與接種環(huán)面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(以免培養(yǎng)過(guò)程中皿蓋冷凝水滴下，沖散巳分離的菌落)。培養(yǎng)后在劃線甲板上觀察沿劃線處長(zhǎng)出的菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。(2)分區(qū)劃線法平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時(shí)每次將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60一70°劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒死后，再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、接種、培養(yǎng)方法與連 續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個(gè)區(qū)，其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第四區(qū)內(nèi)劃線與l、2、3區(qū)線條和接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與l區(qū)線條和平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3～5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋．將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60～70°，右手把接種環(huán)上多余苗體燒死，將燒紅的接種環(huán)在子板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的苗體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第二次早行劃線。第二次劃線完畢，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動(dòng)約60一70°，同樣依次在5、1區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。本次實(shí)驗(yàn)在分離細(xì)菌的平板上選取單菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進(jìn)一步純化。劃線接種后的平板，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

3．微生物菌落計(jì)數(shù)(平板菌落計(jì)數(shù)法)含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活苗細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見的菌落。故可根據(jù)平板上菌落的數(shù)目．推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)。每克菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)＝(同一稀釋度的3個(gè)平板上菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù))/含菌樣品克數(shù)。一般由三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每克含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的 總活菌數(shù)均應(yīng)很接近，不同稀釋度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。通常以第二個(gè)稀釋度的平板上出現(xiàn)50個(gè)左右菌落為好。也可用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

4．平板菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察 從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母茵和霉菌的菌落形態(tài)特征。并用接種環(huán)挑菌，看其與基質(zhì)結(jié)合緊密程度。再用接種環(huán)挑取不同菌落制片，在顯微鏡下進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察。記錄所分離的含菌樣品中明顯不同的各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)。

5.分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面(斜面接種)在分離細(xì)菌、放線菌，酵母苗和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認(rèn)為已經(jīng)純化的苗落各挑選一個(gè)用接種環(huán)接種斜面。將細(xì)菌接種于肉膏蛋白胨斜面，放線菌接種于高氏1號(hào)斜面，酵母菌和霉菌接種于豆芽汁葡萄糖斜面上。貼好標(biāo)簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否為純種，記錄斜面培養(yǎng)條件及苗苔特征。置冰箱保藏。[實(shí)驗(yàn)報(bào)告] 1.簡(jiǎn)述分離微生物純種的原則及列出分離操作過(guò)程的關(guān)鍵無(wú)菌操作技術(shù)。2.四大類微生物的分離方法及培養(yǎng)條件

3.分離的微生物平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

4.樣品中單菌落菌株的菌落培養(yǎng)特征與鏡檢形態(tài) 5.斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征(包括純化結(jié)果)。

[思考題] 1.稀釋分離時(shí)．為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)? 2.劃線分離時(shí)為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉?劃線時(shí)為何不能重疊? 1.3.在恒溫箱中培養(yǎng)微生物時(shí)為何培養(yǎng)皿均需倒置? 4.分離某類微生物時(shí)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)其他類微生物，請(qǐng)說(shuō)明原因。應(yīng)該如何進(jìn)一步分離和純化；經(jīng)過(guò)-次分離的菌種是否皆為純種，若不純，應(yīng)采用哪種分離方法最合適? 5.根據(jù)哪些菌落特征可區(qū)分細(xì)菌、放線苗、酵母菌與霉菌?它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在菌落形態(tài)上有什么聯(lián)系？

第二篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)名稱：用高倍顯微鏡觀察葉綠體和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.初步掌握高倍顯微鏡的使用方法。

2.觀察高等植物的葉綠體在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的形態(tài)和分布

二、實(shí)驗(yàn)原理

高等植物的葉綠體呈橢球狀,在不同的光照條件下,葉綠體可以運(yùn)動(dòng),改變橢球體的方向,這樣既能接受較多的光照,又不至于被強(qiáng)光灼傷。在強(qiáng)光下,葉綠體以其橢球體的側(cè)面朝

向光源;在弱光下,葉綠體以其橢球體的正面朝向光源。因此,在不同光照條件下采集的葫蘆

蘚,其小葉內(nèi)葉綠體橢球體的形狀不完全一樣。

活細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)，可以用細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的葉綠體的運(yùn)動(dòng)做為標(biāo)志。

三、材料用具

蘚類的葉，新鮮的黑藻，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，滴管，鑷子，刀片，培養(yǎng)皿，鉛筆

四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程（見書Ｐ30）

1．制作蘚類葉片的臨時(shí)裝片

2．用顯微鏡觀察葉綠體

3．制作黑藻葉片臨時(shí)裝片

4．用顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)

物理實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ·化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ·生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ·實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式 ·實(shí)驗(yàn)報(bào)告模板

五、討論

1．細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的葉綠體是否靜止不動(dòng)，為什么？

2．葉綠體的形態(tài)和分布與葉綠體的功能有什么關(guān)系？

3．植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)，這對(duì)于活細(xì)胞完成生命活動(dòng)有什么意義？

4．用鉛筆畫一個(gè)葉片細(xì)胞，標(biāo)出葉綠體的大致流動(dòng)方向。

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第三篇：食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

常見微生物的分離培養(yǎng)與觀察

一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，掌握顯微鏡的使用方法，操作原理。

2，了解培養(yǎng)基的制備并掌握制備方法

3，掌握殺菌鍋殺菌方法

4，掌握常見微生物在超凈接種臺(tái)接種方法

5，掌握微生物裝片制備方法，染色，并能在顯微鏡下觀察細(xì)菌裝片

6，在顯微鏡下認(rèn)識(shí)幾種常見微生物并比較

二．實(shí)驗(yàn)原理

1，微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)原理

培養(yǎng)基是人工配置的適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的混合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所以，任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的6大營(yíng)養(yǎng)素，而且比例是合適的，培養(yǎng)基配制好后，必須立即進(jìn)行殺菌，否則很快引起雜菌生長(zhǎng)。配制的培養(yǎng)基有協(xié)調(diào)的營(yíng)養(yǎng)，最適合的物理化學(xué)條件，如滲透壓和PH，等一系列能滿足微生物生長(zhǎng)的條件，所以可以制備不用的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)不同的微生物。如用麥芽汁培養(yǎng)菌培養(yǎng)酵母菌，用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)菌培養(yǎng)霉菌，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)常用細(xì)菌等。

2，顯微鏡使用原理

常見微生物在光學(xué)顯微鏡下或者電子顯微鏡下可見。用顯微鏡能比較清晰的辨別幾種常見微生物并比較。在本次使用的顯微鏡中先插上電源，調(diào)節(jié)光源，把即將觀察的載玻片放到載物臺(tái)，先在低倍鏡下找到所要觀察的細(xì)菌，再切換至中倍鏡和高倍鏡下觀察。

三．實(shí)驗(yàn)操作

1，儀器與試藥以及器材

SW-SJ-2FD潔凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）

BSP-100生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）

JP-500A架盤藥物天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）

01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）SHZ-82恒溫振蕩器（國(guó)華企業(yè)）

電子式可調(diào)萬(wàn)用電爐（南通金石實(shí)業(yè)有限公司）

UB102I生物顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）

打粉機(jī)

瓊脂，土豆（市售），麥芽（藥店），蔗糖（庫(kù)存），氯化鈉，雞蛋，蛋白胨，酵母提取液，美藍(lán)，酒精，結(jié)晶紫，碘液，番紅。

火柴，酒精燈，酒精，棉球，接種棒，棉線，燒杯（5000ml,500ml），錐形瓶，試管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，試管塞，廢報(bào)紙，吸水紙。

2培養(yǎng)基配制

細(xì)菌培養(yǎng)基,蛋白胨10g,酵母抽提物5g，氯化鈉9g加水至1000ml,瓊脂2,5g, 加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補(bǔ)足失水加NaoH至PH7.0，分裝在各個(gè)試管里3ml,其余的分裝在錐形瓶中。加棉花塞，用高溫殺菌鍋殺菌30分鐘。

麥芽汁培養(yǎng)基：見筆記本裝在錐形瓶中

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基： 把馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000ml，煮沸半小時(shí)后，補(bǔ)足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解后加糖20g（用于培養(yǎng)霉菌的加入蔗糖，用于培養(yǎng)酵母菌的加入葡萄糖），補(bǔ)足水分，分裝在錐形瓶中，滅菌，備用。

操作步驟，1，殺菌鍋殺菌過(guò)程：加水至稍微沒過(guò)鍋內(nèi)三腳架，再整齊的放入錐形瓶和試管。蓋上殺菌鍋蓋子，在蓋的時(shí)候要注意將管子放入鍋內(nèi)小孔處，同時(shí)要對(duì)稱的旋轉(zhuǎn)旋鈕，蓋上蓋子，接通電源，將底下溫度開關(guān)調(diào)至最大處，打開放氣閥，從看到氣體出現(xiàn)起，計(jì)時(shí)20分鐘后，關(guān)掉放氣閥，觀察壓力閥至0。1千帕?xí)r，調(diào)整溫度旋鈕至綠燈熄滅，計(jì)時(shí)15分鐘。關(guān)掉電源，冷卻至壓力閥指針到0帕。結(jié)束殺菌，打開放氣閥放出剩余氣體。打開殺菌鍋鍋蓋，取出各個(gè)試劑瓶。

2，分裝各種微生物，將從殺菌鍋取出的試劑分開裝，將試管整齊排放到由廢舊報(bào)紙折成的斜面上，為金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)備用。將裝有麥芽汁培養(yǎng)基的錐形瓶取出為酵母菌培養(yǎng)備用。將裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的錐形瓶分別倒入培養(yǎng)皿中，為培養(yǎng)沙門氏菌備用。將裝有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的錐形瓶分別裝入培養(yǎng)皿中，為霉菌的培養(yǎng)做備用。

第四篇：《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)報(bào)告

《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)一

［實(shí)驗(yàn)名稱］：沉淀反應(yīng)

［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模荩和ㄟ^(guò)單向瓊脂擴(kuò)散測(cè)定待測(cè)血清Ig含量

［實(shí)驗(yàn)材料］：１％離子瓊脂、白喉類毒素、白喉抗毒素、載玻片、毛細(xì)吸管

打孔器

［試驗(yàn)步驟］：（１）將溶解后的離子瓊脂冷卻到４５０Ｃ，加入適當(dāng)濃度的抗原混合均勻，吸取３－４毫升加在載玻片上，使其均勻布滿載玻片而又

不流失。

（２）瓊脂凝固后制成凝膠板，然后隔適當(dāng)距離打孔。

（３）在孔內(nèi)滴加待測(cè)可溶性抗體。

（４）將凝膠平板放入帶蓋瓷盤中，下面墊一濕紗布以保持濕度，置于

３７０Ｃ恒溫箱中２４小時(shí)，觀察沉淀環(huán)。

［實(shí)驗(yàn)結(jié)果］：（沉淀環(huán)直徑）

測(cè)量沉淀環(huán)直徑：。

［實(shí)驗(yàn)分析］單向瓊脂擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)，主要用來(lái)測(cè)定標(biāo)本中各種免疫球蛋

白或補(bǔ)體成分的含量。

在孔中加入待測(cè)抗體使其向四周擴(kuò)散，經(jīng)一定時(shí)間后抗體與瓊脂中

抗原相遇，在比例適宜處生成白色沉淀環(huán)。

沉淀環(huán)直徑與抗體濃度成正比。根據(jù)測(cè)試樣品沉淀環(huán)直徑的大小，可從已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品中抗體的含量。

實(shí)驗(yàn)二

［實(shí)驗(yàn)名稱］：間接凝集抑制試驗(yàn)（妊娠試驗(yàn)）

［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模荩簻y(cè)定待檢尿液中是否含ＨＣＧ（絨毛膜促性腺激素）以診斷妊娠

［實(shí)驗(yàn)材料］：孕婦尿液、非孕婦尿液、ＨＣＧ致敏乳膠抗原、抗ＨＣＧ血清、載玻

片等

［試驗(yàn)步驟］：

（１）取一片載玻片，標(biāo)記出左右。

（２）在載玻片左側(cè)加一滴待檢尿液，右側(cè)加一滴非孕婦尿液。

（３）在兩側(cè)尿液中分別加一滴抗ＨＣＧ血清，搖動(dòng)混勻２－３分鐘。

（４）在兩側(cè)液滴中分別再加一滴ＨＣＧ致敏乳膠抗原，搖動(dòng)混勻２－３分鐘。（５）觀察判定結(jié)果。

［實(shí)驗(yàn)結(jié)果］：（凝集和非凝集的描述）

左側(cè)（待檢尿液側(cè)）呈現(xiàn)均勻的乳狀液狀態(tài)，無(wú)凝集顆粒。間接凝集抑制陽(yáng)性。右測(cè)（非孕婦尿液側(cè)）出現(xiàn)明顯的凝集顆粒。間接凝集抑制陰性。

［實(shí)驗(yàn)分析］：（結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理）

孕婦尿液中的ＨＣＧ含量顯著增高。尿液中的ＨＣＧ與加入的抗ＨＣＧ結(jié)合，抗ＨＣＧ被消耗，使得加入的ＨＣＧ乳膠抗原不能再與抗ＨＣＧ結(jié)合，不出現(xiàn)乳膠抗原間接凝集反應(yīng)（凝集被抑制），所以液滴呈現(xiàn)均勻乳狀液，為乳膠間接凝集抑制陽(yáng)性反應(yīng)。

非孕婦尿液中ＨＣＧ含量極少，不足以抑制抗ＨＣＧ與ＨＣＧ乳膠抗原發(fā)生間接凝集反應(yīng)，所以出現(xiàn)乳膠顆粒的凝集，為乳膠間接凝集抑制陰性反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)三

［實(shí)驗(yàn)名稱］： 細(xì)菌形態(tài)、特殊結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡頭使用

［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模荩?認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)，學(xué)會(huì)使用顯微鏡油鏡頭

［實(shí)驗(yàn)材料］： 顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、球菌標(biāo)本片、桿菌標(biāo)本片、弧菌

標(biāo)本片、莢膜標(biāo)本片、芽孢標(biāo)本片、鞭毛標(biāo)本片

［試驗(yàn)步驟］：

（一）顯微鏡油鏡頭的使用

１、用油鏡觀察時(shí)光線宜強(qiáng)，可將聚光器升高，開大光圈。

２、在標(biāo)本片上滴加一滴香柏油。

３、眼睛從鏡筒側(cè)面觀察，同時(shí)緩慢將鏡筒調(diào)至鏡頭浸入香柏油中（勿接觸標(biāo)本片）。４、眼睛移至目鏡。先用粗調(diào)焦螺旋緩慢將油鏡調(diào)離標(biāo)本玻片直至觀察到模糊物象，再用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)至物象清晰。觀察。

５、觀察完畢后把油鏡頭擦拭干凈，顯微鏡復(fù)位收好。

（二）細(xì)菌基本形態(tài)的觀察

（三）細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察（示教）

［實(shí)驗(yàn)結(jié)果］：（繪圖）根據(jù)觀察結(jié)果繪制細(xì)菌基本形態(tài)、特殊結(jié)構(gòu)圖（不少于兩幅）［實(shí)驗(yàn)分析］：（結(jié)合結(jié)構(gòu)的功能）

１、細(xì)菌的基本形態(tài)有球形、球桿形、桿形、弧形、螺旋形五種形態(tài)。

２、某些細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)，可分泌一些粘液性物質(zhì)包繞在細(xì)胞壁外圍，稱為莢膜，用特殊染色法可將莢膜染成與菌體不同的顏色。莢膜具有抗原性，可以鑒別細(xì)菌或細(xì)菌分型；細(xì)菌的莢膜與其致病性有關(guān)。

３、某些細(xì)菌由細(xì)胞質(zhì)伸出的細(xì)長(zhǎng)彎曲的蛋白質(zhì)絲狀物，稱為鞭毛。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，鞭毛具有較強(qiáng)的抗原性，有些細(xì)菌的鞭毛與其致病性有關(guān)。

４、某些Ｇ－的菌體上有比鞭毛細(xì)、短而直、數(shù)量多的絲狀物，稱為菌毛，主要成分

是蛋白質(zhì)。菌毛分普通菌毛（與細(xì)菌致病力有關(guān)）和性菌毛（傳遞遺傳物質(zhì)、使

受體菌獲得某些相應(yīng)性狀）

５、某些Ｇ＋在體內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的環(huán)境下，細(xì)胞漿發(fā)生脫水濃縮，在菌體內(nèi)形成一個(gè)折光性強(qiáng)、通透性低的圓形或橢圓形小體，稱為芽孢。用特殊染色法可將芽孢染成與菌體不同的顏色。芽孢的大小、形態(tài)和位置隨菌種不同而有差異，有助于細(xì)菌的鑒別；芽孢對(duì)熱、干燥、化學(xué)消毒劑和輻射都有較強(qiáng)的抵抗力。

實(shí)驗(yàn)四

［實(shí)驗(yàn)名稱］： 細(xì)菌人工培養(yǎng)性狀觀察及革蘭氏染色法

［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模荩?觀察細(xì)菌菌落形態(tài)、溶血現(xiàn)象、色素；細(xì)菌標(biāo)本的涂片和革蘭氏染色

法檢查

［實(shí)驗(yàn)材料］： 細(xì)菌人工培養(yǎng)性狀觀察示教片、大腸桿菌菌落、葡萄球菌菌落、載玻

片、生理鹽水、接種環(huán)、酒精燈、結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%酒

精、復(fù)紅染液、顯微鏡等

［試驗(yàn)步驟］：

（一）細(xì)菌菌落形態(tài)、溶血現(xiàn)象、色素等觀察（示教）

（二）細(xì)菌標(biāo)本的涂片

１、取兩張潔凈的載玻片，分別滴加一滴生理鹽水。

２、以無(wú)菌操作法，用接種環(huán)分別挑取少許大腸桿菌菌落和葡萄球菌菌落，分別涂

于兩張載玻片的生理鹽水中研成均勻混濁的菌膜（不可過(guò)厚）后自然干燥。３、將干燥后的標(biāo)本片在酒精燈的火焰上方快速通過(guò)三次，予以固定。

（三）染色將制好的標(biāo)本片按下列步驟進(jìn)行染色

１、在兩片標(biāo)本片上分別滴加結(jié)晶紫染液初染１分鐘，水洗。

２、滴加盧戈氏碘液媒染１分鐘，水洗。

３、滴加９５％酒精，搖動(dòng)載片０．５－１分鐘脫色至恰無(wú)紫色退下，水洗。４、滴加稀釋復(fù)紅染液，復(fù)染０．５－１分鐘，水洗，干燥。

５、鏡檢。葡萄球菌（Ｇ＋球菌）染成紫色，大腸桿菌（Ｇ－菌）染成紅色。

［實(shí)驗(yàn)結(jié)果］：（描述不同細(xì)菌菌落的區(qū)別，繪圖表示革蘭氏染色的鏡下結(jié)果）１、液體培養(yǎng)基中：葡萄球菌呈均勻混濁生長(zhǎng)，鏈球菌呈沉淀生長(zhǎng)，枯草桿菌形成菌

膜；在普通瓊脂平板上：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生脂溶性金黃色色素使菌落呈現(xiàn)金黃色但培養(yǎng)基顏色不變，綠膿桿菌產(chǎn)生水溶性色素使培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色；在血瓊脂平

板上：金黃色葡萄球菌菌落周圍形成透明的溶血環(huán)，甲型溶血性鏈球菌菌落周圍形成狹窄的草綠色溶血環(huán)，乙型溶血性鏈球菌菌落周圍形成寬而透明的溶血環(huán)。２、繪圖表示大腸桿菌、葡萄球菌經(jīng)革蘭氏染色后的鏡檢結(jié)果

［實(shí)驗(yàn)分析］：（結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)造分析革蘭氏染色法結(jié)果及意義）

結(jié)果：

Ｇ＋菌的細(xì)胞壁由肽聚糖（三維空間結(jié)構(gòu)）和磷壁酸組成，在酒精作用下通透性降低，而且Ｇ＋菌的等電點(diǎn)較低，帶負(fù)電荷多，結(jié)合堿性染料多，因此結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不易被酒精脫除被染成紫色。

Ｇ－菌的細(xì)胞壁由肽聚糖（疏松薄弱的二維結(jié)構(gòu)）、脂蛋白、外膜、脂多糖等成分組成，在酒精作用下通透性增高，而且Ｇ－菌的等電點(diǎn)較高，結(jié)合堿性染料較少，因此初染的結(jié)晶紫被酒精脫色而被復(fù)紅復(fù)染成紅色。

意義：

１、鑒定細(xì)菌２、指導(dǎo)臨床選擇藥物３、研究和了解細(xì)菌的致病性

第五篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等?？傊?，測(cè)定微生物生長(zhǎng)量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。

一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。

2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說(shuō)明書。

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬(wàn)分之一毫升)。

圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（一）圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室

1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室

計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。

設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則

1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）

同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>

2．鏡檢計(jì)數(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。

取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計(jì)數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。

5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

l．結(jié)果

將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測(cè)方法。

二平板菌落計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可來(lái)自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。

平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

3．儀器或其他用具lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有4.5ml無(wú)菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。

（四）操作步驟

l．編號(hào)

取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無(wú)菌水的試管，依次標(biāo)是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個(gè)過(guò)程如圖15-3所示。

放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．計(jì)數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過(guò)少菌液不易涂布開，過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．結(jié)果

2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。

(4)當(dāng)你的平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問(wèn)題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?

三 光電比濁計(jì)數(shù)法

一、目的要求

1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。

2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。

二、基本原理

當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，菌體計(jì)數(shù)可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)或細(xì)胞干重測(cè)定等方法。本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長(zhǎng)等因素的影響。因此，對(duì)于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過(guò)最大吸收波長(zhǎng)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)來(lái)確定。另外，對(duì)于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測(cè)定。

圖15—4 比濁法測(cè)定細(xì)胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無(wú)菌吸管，無(wú)菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）編號(hào) 取無(wú)菌試管7支，分別用記號(hào)筆將試管編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調(diào)整菌液濃度 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時(shí)的釀酒酵母菌懸液，并用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細(xì)胞懸液。再分別裝入已編好號(hào)的1至7號(hào)無(wú)菌試管中。

（3）測(cè)OD值 將1至7號(hào)不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長(zhǎng)、1cm比色皿中測(cè)定OD值。比色測(cè)定時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照，并將OD值填入下表

管號(hào)12345678

細(xì)胞數(shù)106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測(cè)定OD值時(shí)均必須先搖勻后再倒入比色皿中測(cè)定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標(biāo)，以每毫升細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．樣品測(cè)定

將待測(cè)樣品用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用560nm波長(zhǎng)、lcm比色皿測(cè)定光密度。測(cè)定時(shí)用無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照。

各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相同，否則，測(cè)得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。

3．根據(jù)所測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)。

（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

l．結(jié)果

每毫升樣品原液菌數(shù)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)

2．思考題

(1)光電比濁計(jì)數(shù)的原理是什么?這種計(jì)數(shù)法有何優(yōu)缺點(diǎn)?

(2)光電比濁計(jì)數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應(yīng)用價(jià)值?

(3)本實(shí)驗(yàn)為什么采用560nm波長(zhǎng)測(cè)定酵母菌懸液的光密度?如果你在實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值，你將如何選擇波長(zhǎng)?

四 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

(一)目的要求

1．通過(guò)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長(zhǎng)線。

2．復(fù)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。

(二)基本原理

大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期，對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長(zhǎng)曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長(zhǎng)曲線也不相同。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，這對(duì)人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長(zhǎng)具有重要意義。

用于測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的方法已在上述實(shí)驗(yàn)作了介紹。本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)(spectrophotometer)進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。也可以直接用試管或帶有測(cè)定管的三角瓶(圖15-5)測(cè)定“klett units”值的光度計(jì)。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個(gè)帶測(cè)定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時(shí)間(橫坐標(biāo))取樣測(cè)定，以測(cè)得的klett units為縱坐標(biāo)，便可很方便地繪制出細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/0.002換算出所測(cè)菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計(jì)，水浴振蕩搖床，無(wú)菌試管，無(wú)菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測(cè)OD值

(四)操作步驟

1．標(biāo)記

取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無(wú)菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無(wú)菌大試管中。

3．培養(yǎng)

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值。

4．比濁測(cè)定

用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡(jiǎn)便的方法代替：

1．用1ml無(wú)菌吸管取0.25ml大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計(jì)的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個(gè)大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測(cè)定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測(cè)定OD值。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測(cè)定的準(zhǔn)確度愈高。

(五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．結(jié)果

(1)將測(cè)定的OD600值填入下表：

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長(zhǎng)曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同？?jī)烧吒饔惺裁磧?yōu)缺點(diǎn)？

(2)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細(xì)胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達(dá)2×108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時(shí)。

(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個(gè)時(shí)期？根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？

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