第一篇：血液標(biāo)本抽提DNA

抗凝全血中提取DNA

準(zhǔn)備： 配制80%異丙醇和70%乙醇各1ml備用。選擇2ml的 離心管。血液的體積為2ml。先向2ml的離心管中加入1ml的血液。后加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。再加入1ml的血液，再加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。注意： 使用底部帶有棱角的離心管，以防倒上清時(shí)，沉淀滑出離心管。

如果血液體積超過(guò)1/2離心管的體積，可分兩次進(jìn)行處理。目的：buffer MG-A的作用是快速裂解細(xì)胞，并且促使DNA形成容易沉淀的凝聚物。加入1ml的buffer MG-A。Vortex充分震蕩，10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。加入1ml的buffer MGS, Vortex充分震蕩，10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。將離心管倒扣在吸水上2min；或者簡(jiǎn)短離心，仔細(xì)吸除殘留的上清。

目的： 洗滌去除DNA凝聚物中的蛋白。加入1ml buffer MGL和10ul Proteinase K，Vortex震蕩懸浮沉淀。6 65℃水浴30min（或者更長(zhǎng)時(shí)間，可過(guò)夜），間斷搖晃混合。目的：降解蛋白，釋放DNA 10000xg 離心 30s，將上清緩慢倒入一個(gè)干凈的2ml的離心管，加入800ul 80%異丙醇；緩慢翻轉(zhuǎn)離心管20次（出現(xiàn)絲狀或簇裝DNA凝聚物）,再劇烈搖晃20次使DNA凝聚物變得更緊密。10000xg 30s，緩慢倒掉上清。

注意： 在出現(xiàn)絲狀或簇狀DNA凝聚物后，需劇烈搖晃去除可能包裹在DNA凝膠中的溶液，不然最后DNA溶解困難，或DNA中有鹽殘留。

在出現(xiàn)DNA凝聚物之前，DNA為溶解狀態(tài)，需要緩慢翻轉(zhuǎn)離心管。目的：異丙醇能夠沉淀DNA 加入1000ul 70% 乙醇，劇烈搖晃20次；10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。

目的：洗滌去除鹽成分。將離心管倒置在干凈的吸水紙上至少5min，或者簡(jiǎn)短離心，仔細(xì)吸除殘留的乙醇（勿吸除沉淀）。室溫放置10min或者37℃ 放置5min揮發(fā)乙醇，干燥至DNA沉淀為半濕潤(rùn)狀態(tài)，無(wú)酒精味，效果最佳。目的：干燥揮發(fā)乙醇。加入至少200ulTE，提速Vortex 震蕩5s或者劇烈搖晃10次，65℃水浴10-60min 溶解DNA，水浴5min后輕彈離心管底部打散DNA凝聚物（一般繼續(xù)水浴10min 后即可完全溶解）；或者65℃水浴過(guò)夜。

注意：水浴后，DNA為溶解狀態(tài)，應(yīng)避免劇烈操作。目的：溶解DNA。

第二篇：質(zhì)粒DNA抽提實(shí)驗(yàn)報(bào)告

質(zhì)粒DNA抽提實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.掌握堿裂解法小量快速提取質(zhì)粒DNA的方法，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切，PCR擴(kuò)增等。

2.學(xué)習(xí)利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測(cè)DNA的純度，構(gòu)型，含量和分子量大小。

二．實(shí)驗(yàn)原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DN結(jié)果A的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。三．實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：

1.5mlEP管、高速離心機(jī)、移液槍

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．實(shí)驗(yàn)步驟:

1、取1.5ml細(xì)胞培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1min，去上清液（重復(fù)一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重懸浮細(xì)胞

3、加200μl溶液Ⅱ，輕輕搖勻，放置5min

4、加150μl溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min

5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min

6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min 7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存?zhèn)溆?/p>

五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果：得到大腸桿菌質(zhì)粒DNA

PCR以及電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一．實(shí)驗(yàn)原理：

PCR：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來(lái)進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。

二．實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：

EP管、離心機(jī)、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測(cè)儀等 DNA模板、與特定DNA模板結(jié)合的引物、去離子水、商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠

三．PCR反應(yīng)體系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步驟 1、94℃預(yù)變性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循環(huán)7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循環(huán)23次 3、72℃，10s

4、電泳檢測(cè)

五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見下表：

如右圖所示：實(shí)驗(yàn)所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實(shí)驗(yàn)的DNA條帶位置在500bp-750bp之間，接近500bp，證明實(shí)驗(yàn)是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 實(shí)驗(yàn)組

對(duì)照組

第三篇：DNA抽提試劑盒簡(jiǎn)介

一．上海生工的試劑盒：

1.基因組小量抽提試劑盒

BS47350Extractions350元BBI

BS474100Extractions420元BBI

SK125150次280元Sangon

SK1252100次380元Sangon

基本說(shuō)明：通過(guò)將組織細(xì)胞裂解后，以RnaseA和Proteinase K消化降解RNA和蛋白質(zhì)。然后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單抽提、沉淀獲得基因組DNA。本試劑盒適用于從人或動(dòng)物的血液、培養(yǎng)細(xì)胞、各種組織、Gram+/Gram-細(xì)菌中快速抽提基因組DNA。

主要特點(diǎn)：1.整個(gè)抽提過(guò)程30分鐘，氯仿抽提僅一次，無(wú)需酚抽提。

2.本試劑盒抽提DNA能用于幾乎所有生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.按樣品準(zhǔn)備方法得到的200微升樣品中可獲得2~10微克DNA。

2.UNIQ-10柱式血液基因組抽提試劑盒

BS48350Extractions390元BBI

BS484100Extractions760元BBI

SK126150次380元Sangon

SK1262100次690元Sangon

基本說(shuō)明：UNIQ-10柱含有特異性吸附DNA的膜。利用最新研發(fā)的血液處理試劑，能特異有效地將血液中白細(xì)胞的DNA釋放到溶液上清中，有利于膜對(duì)血液基因組DNA的吸附。經(jīng)洗滌除去非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，然后用Elution Buffer洗脫。試用于從人和動(dòng)物外周血貨其他途徑收集的血液中抽提基因組DNA。

主要特點(diǎn)：1.抓們針對(duì)血液基因組DNA的抽提。

2.DNA純度好，產(chǎn)率高。

3.快速、簡(jiǎn)便。

第四篇：血液總RNA抽提

血液總RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液體中RNA的抽提）中，劇烈震蕩，靜置。2.加入200ul 三氯甲烷，劇烈震蕩，靜置10min。3.4度，12000g 離心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(與所吸出的上清比列為1:1)異丙醇，并加入1ul的糖原，輕輕上下顛倒混勻，-20度冰箱沉淀過(guò)夜。5.4度，12000g 離心15min。留沉淀（RNA），將上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下顛倒，洗滌RNA沉淀。6.4度7500g離心10min。去上清，將沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第五篇：以Chelex100為介質(zhì)抽提DNA解析

以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA

近年來(lái)，DNA的分析技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)的研究中。獲取DNA的傳統(tǒng)方法是以新鮮、-70℃或液氮保存的標(biāo)本為材料，通過(guò)蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提而獲取DNA。1987年，F(xiàn)ey等［1］首先用NP40成功地從骨髓涂片中提取到較高分子量的DNA，用于Southern印跡分析。國(guó)內(nèi)的一些學(xué)者［2,3］也用相似的方法，從骨髓涂片中提取到DNA。但這兩種方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步驟，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)。同時(shí)，需要在多個(gè)離心管之間轉(zhuǎn)移，增加了標(biāo)本間的交叉污染。由于PCR技術(shù)對(duì)DNA樣品的純度和分子量的要求相對(duì)較低：對(duì)微量的DNA即可擴(kuò)增，且只需待擴(kuò)增的靶序列完整即可，不要求高分子量。因此，部分降解的DNA均可作PCR檢測(cè)。由于PCR有極高的敏感度，需嚴(yán)格控制標(biāo)本間的交叉污染，同時(shí)為了適應(yīng)血液系統(tǒng)惡性腫瘤標(biāo)本來(lái)源的特點(diǎn)，我們通過(guò)與常規(guī)酚、氯仿提取DNA進(jìn)行比較，以了解以Chelex 100為介質(zhì)提取DNA對(duì)PCR的影響。

一、材料和方法

1.細(xì)胞：(1)細(xì)胞株：B-NHL細(xì)胞株-村林細(xì)胞。(2)外周血有核細(xì)胞：由健康志愿者提供。

2.DNA獲取率比較：(1)將不同培養(yǎng)瓶中已培養(yǎng)的村林細(xì)胞混合；A組取10份，5 ml/份；B組取10份，0.5ml/份。(2)A組用酚、氯仿抽提DNA ：按Sambrook等［4］介紹的方法提取DNA。(3)B組用Chelex 100為介質(zhì)提取DNA：將已培養(yǎng)定量的村林細(xì)胞加入Eppendorf管中，加去離子水1ml，間歇振蕩30 分鐘。15 000r/min離心5分鐘，棄去上清液470 μl，加10% Chelex 100 170 μl，56℃溫育30分鐘。超速振蕩15秒，沸水浴8分鐘，15 000 r/min離心5分鐘，上清液即為DNA模板［5］。(4)DNA定量：在微量紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)兩種不同方法提取DNA的吸光度(A，曾稱光密度OD)值，換算出DNA的濃度和獲得量：

DNA濃度(μg/ml)=OD260 ×50×稀釋倍數(shù)

DNA獲得量(μg)=DNA濃度×DNA溶液體積(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用兩樣本均數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。

［4］

3.PCR敏感性比較：(1)外周血有核細(xì)胞DNA的提取：按Sambrook等方法用酚、氯仿提取。(2)實(shí)驗(yàn)分組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細(xì)胞DNA與外周血有核細(xì)胞DNA混合為A組；以酚、氯仿抽提的村林細(xì)胞DNA與外周血有核細(xì)胞DNA混合為B組，使村林細(xì)胞DNA含量分別為5%、1%、0.5%、0.3%、0.2%和0.1%。(3)PCR擴(kuò)增：取1μgDNA，選用IgH基因重排引物，按Trainor等［6］方法進(jìn)行Semi-nest擴(kuò)增。(4)取PCR產(chǎn)物15 μl于8%聚丙烯酰胺凝膠200V電泳2小時(shí)，EB染色，紫外燈下觀測(cè)，拍照。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.PCR準(zhǔn)確性的比較：(1)PCR擴(kuò)增：分別以Chelex 100法和酚、氯仿法抽提的50ng DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，方法同前。(2)SSCP檢測(cè)：按Yap等方法進(jìn)行［7］。(3)銀染：1%硝酸浸泡5分鐘，去離子水沖洗2次；0.2%硝酸銀浸泡3～5分鐘，去離子水沖洗2次；3%無(wú)水碳酸鈉顯影至條帶清晰而背景不至過(guò)深，10%乙酸浸泡5分鐘，停止反應(yīng)。風(fēng)干后拍照。重復(fù)3次。

5.血紅蛋白對(duì)PCR敏感性的影響：(1)以Chelex 100 為介質(zhì)提取村林細(xì)胞DNA：方法同前。(2)用健康志愿者外周血10 μl，按以Chelex 100 為介質(zhì)抽提DNA的方法和過(guò)程，對(duì)其進(jìn)行處理。(3)用酚、氯仿抽提外周血有核細(xì)胞DNA：方法同前。(4)用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA的含量：方法同前。A組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細(xì)胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核細(xì)胞DNA稀釋。PCR擴(kuò)增時(shí)模板加量分別為1 μg。B組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細(xì)胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核細(xì)胞DNA稀釋。PCR擴(kuò)增時(shí)的模板加量也為1 μg，但同時(shí)加5 μl的本節(jié)實(shí)驗(yàn)步驟2處理后的上清液。(5)PCR擴(kuò)增、電泳、染色及拍照：同前。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、結(jié)果

1.兩種不同方法提取DNA時(shí)的獲取率：酚、氯仿抽提組:5ml村林細(xì)胞的DNA的平均獲取量為82.4 μg±1.04 μg。Chelex 100組，0.5ml村林細(xì)胞的DNA的平均獲取量9.10 μg±2.84 μg。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，t值為0.899 5，P=0.380 25，兩組間的差異無(wú)顯著性。

2.兩種不同DNA提取方法PCR敏感性的比較：用以Chelex 100為介質(zhì)抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其可檢測(cè)的最低含量為0.3%，即3ng/1 μg。用酚、氯仿抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其可檢測(cè)的最低含量為0.2%，即2ng/1 μg(1)。

1～6:稀釋度分別為0.1％、0.2%、0.3%、0.5%、1%、5%，M：Marker Marker左側(cè)為以Chelex 100為介質(zhì)抽提組，右側(cè)為酚、氯仿抽提組 1 兩種不同方法抽提DNA后梯度稀釋、PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.兩者不同DNA提取方法的PCR準(zhǔn)確性的比較：結(jié)果顯示單鏈位置無(wú)差異，表明以Chelex 100為介質(zhì)抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)SSCP及銀染后與經(jīng)酚、氯仿抽提的無(wú)差異。

4.血紅蛋白的存在對(duì)PCR敏感性的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在紫外燈下亮度無(wú)差異，表明，用Chelex 100 為介質(zhì)抽提DNA時(shí)，紅細(xì)胞的存在與否，不影響PCR的敏感性（2）。

1～4:稀釋度分別為0.3%、0.5%、1%、5%；M:Marker;Marker左側(cè)為不含血組,右側(cè)為含血組 含血與不含血標(biāo)本PCR擴(kuò)增結(jié)果

三、討論

在有關(guān)分子生物學(xué)的研究中，DNA提取的方法很多，但由于操作步驟多易污染，所用的有機(jī)溶劑對(duì)人體有害，且標(biāo)本量要求多，保存要求高；或者由于DNA的獲取量少，且有PCR擴(kuò)增的抑制因素的存在，使PCR擴(kuò)增的結(jié)果不穩(wěn)定［5］，嚴(yán)重影響了該方法在某些方面的應(yīng)用。

Chelex 100 做為一種離子螯合劑，由苯乙烯和苯二乙烯組成。其懸液在堿性環(huán)境(pH 10-11)和100℃的條件下，可導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂和DNA的變性并釋放出來(lái)［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩種不同抽提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法的比較，發(fā)現(xiàn)以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA時(shí)，DNA的獲取率與經(jīng)典的酚、氯仿抽提法的無(wú)差異。這是由于前一方法雖然存在DNA釋放得是否完全以及仍有一部分由于高溫而降解的問(wèn)題［8］，但酚、氯仿抽提時(shí)由于抽提過(guò)程中含有DNA的水相在轉(zhuǎn)移過(guò)程中不可避免地要損失一部分，使得DNA的獲取率也降低，導(dǎo)致二者在DNA的獲取率方面差異無(wú)顯著性。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，用此方法抽提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的閾值高于經(jīng)典的酚、氯仿抽提法的：閾值分別為0.3%和0.2%，而忠實(shí)性無(wú)影響。DNA在［8］100℃的條件下，可發(fā)生大量的降解，Sepp等研究證明，沸水浴處理后，所得的DNA的片段在200 bp以下，且量少。這主要是由于標(biāo)本中的金屬離子在高溫和低離子強(qiáng)度的條件下對(duì)DNA降解的催化作用所致［5］。而在有Chelex 100存在的條件下，金屬離子被結(jié)合，阻止了其對(duì)DNA降解的催化作用，同時(shí)，由于Chelex 100 的顆粒在離心后沉淀下來(lái)，不會(huì)干擾PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度，且借助于PCR反應(yīng)體系中緩沖液，其堿性的上清液也不會(huì)影響到PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。但是，由于高溫本身也有一定程度降解DNA的作用，使得該方法提取的DNA片段在1 000 bp以下［8］，其中可含有低于80bp的小片段，也可出現(xiàn)DNA片段斷裂在PCR擴(kuò)增的靶序列區(qū)域內(nèi)。這使得有效的靶序列的拷貝數(shù)減少，導(dǎo)致了用以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法的閾值稍高于酚、氯仿抽提法的閾值，而PCR的忠實(shí)性無(wú)影響。

再者，本實(shí)驗(yàn)中，兩種不同DNA抽提方法在用梯度稀釋進(jìn)行敏感度檢測(cè)時(shí)的敏感度分別為0.3%(3ng/1 μg)和2%(2ng/1 μg)。由于0.1 μg外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA約含有104個(gè)不同的重鏈基因，上述敏感度分別相當(dāng)于1 000個(gè)外周血有核細(xì)胞中可檢出3個(gè)和2個(gè)腫瘤細(xì)胞。

另外，在含血的標(biāo)本中，血紅蛋白去除不徹底，其中的卟啉化合物可抑制PCR擴(kuò)增。在酚、氯仿抽提時(shí)，由于蛋白質(zhì)被去除，也可通過(guò)預(yù)先去除紅細(xì)胞，使得卟啉化合物得到去除或明顯減少。而在以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA時(shí)，由于未用蛋白酶K消化，卟啉化合物很少?gòu)难t蛋白中釋放出來(lái)，且可能還可以通過(guò)與Chelex 100結(jié)合，使得PCR擴(kuò)增不受影響［5］，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。

由于此方法獲取的DNA的片段小于1 000 bp，故不能用于擴(kuò)增靶片段大于1 000 bp的PCR實(shí)驗(yàn)中，也不適用于Southern雜交中，應(yīng)引起注意。

作者單位：200092 上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)血液／腫瘤科（步嶸、王耀平）；上海鐵道大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬甘泉醫(yī)院檢驗(yàn)科（葉元康）

參考文獻(xiàn)

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(收稿：1998-08-15 修回：1999-07-23)