第一篇：酚氯仿抽提解析大全

DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象。DNA的提取是分子生物學實驗技術中的最重要、最基本的操作。本實驗通過植物樣品在液氮下研磨以粉碎組織，通過裂解液裂解細胞，有機溶劑反復抽提，使DNA進入水相與蛋白質(zhì)成分分開，在RNase作用下，降解RNA以純化DNA。

二、材料以方法

1、材料：培養(yǎng)菌體

2、儀器設備：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，高速冷凍離心機，臺式離心機，移液槍一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀

3、試劑：

細胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 飽和酚，氯仿/異戊醇，酚/氯仿/異戊醇 無水乙醇，70％乙醇，異丙醇 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE緩沖液，電泳載樣緩沖液

三、操作步驟（1）培養(yǎng)菌體

（2）加入10 ml裂解液，1/10體積酚，于65℃下20－30 min，然后加入等體積的氯仿，輕搖（3）12000－15000rpm離心15 min（4）取上淸液，加入等體積氯仿，輕搖，12000－15000rpm離心15 min（5）取上淸液，加入0.6倍體積冷異丙醇（-20℃）或2倍體積冷無水乙醇（-20℃）（6）加入1/10體積的3 M NaAc(pH5.2)，置于室溫下10 min（7）12000－15000rpm離心10 min（8）倒棄液體留下沉淀，用70％乙醇洗滌沉淀（9）加入2倍體積無水乙醇（10）12000－15000rpm離心10 min（11）倒棄液體留下沉淀，真空干燥（12）復溶于2 ml TE（13）加入RNase，65℃或37℃處理10－30 min（14）加等體積酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm離心10 min（15）取上淸液，加入0.6倍體積冷異丙醇（-20℃）或2倍體積冷無水乙醇（-20℃）（16）加入1/10體積的3 M NaAc(PH5.2)，置于室溫下10 min（17）12000－15000rpm離心10 min（18）倒棄液體留下沉淀，用70％乙醇洗滌沉淀（19）真空干燥沉淀

（20）復溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分裝成小體積，4℃或-20℃保存。（21）電泳檢測提取DNA的質(zhì)量

四、結(jié)果與分析

點樣空，若發(fā)亮則說明有污染 超螺旋結(jié)構DNA，若條帶有拖尾則 說明有破碎的DNA 少量未清除的RNA

五、注意事項

1、重點防止DNA的損傷，包括各種物理、化學和機械損傷。

2、干燥好的染色體DNA最好溶于去離子水，以備后面直接利用。如果用TE 緩沖液溶解，后面還需去離子。

3、取上清時，如果上清液過少，可再加入少量水，重新離心，取上清，避免DNA損失過多。

第二篇：苯酚-氯仿法從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

一、試劑與材料

⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0)100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)10mg/ml(溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用時，終濃度達到100ug/ml

⑶ RNaseA RNaseA溶液配制

將RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸鈉（pH5.2）中，使終濃度為10mg／ml，加熱到 100℃，15min。室溫下緩慢冷卻，用0.1體積的1M的Tris-Cl調(diào)整pH至7.4后，小管分裝保存在-20℃。使用時，終濃度為100ug/ml.⑷ Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(體積比)3M 醋酸鈉（pH5.2）；

無水乙醇； 70%乙醇；

無菌ddH2O.⑸ 手術剪，1.5mlEP管.二、方法

⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(約20-30mg)，立即放入細胞凍存管并投入液氮中（防止基因組DNA降解）。

⑵ 從液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混勻。

⑶ 在熱孵育器中，55℃過夜。（剛開始可每隔30min搖晃一次）

后續(xù)操作可在冰上進行---⑷ 取出EP管，加入等體積Tris平衡苯酚，用力搖晃3min；12000g，離心10分鐘。

⑸ 輕輕吸取上清至一新的1.5mlEP管中（寧可少吸，也不要吸到下層的苯酚或沉淀物）。

⑹ 向上清中加入等體積苯酚/氯仿，用力搖晃2分鐘；12000g，離心2分鐘。⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無水乙醇，搖勻。

⑻ 12000g，離心1分鐘，盡可能吸除上層乙醇。

⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力搖勻。（此步為了去除殘留的SDS和苯酚）

⑽ 12000g，離心1分鐘，去除乙醇，再重復⑼、⑽一次（為了盡可能把DNA清洗干凈）。

⑾ 將EP管倒置在吸水紙上，以吸干乙醇。

⑿ 用65℃預熱的無菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。⒀ 分光光度計檢測純度、濃度。

DNA提取的注意事項

1、裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時應注意防護。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內(nèi)切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA，不能攪動基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時，要用專用的粗口吸頭，普通吸頭可能會切斷DNA或造成DNA缺口。

12、基因組應4度保存，如-20度保存可能導致DNA斷裂。

13、在準備實驗的過程中，應將DNA樣品放在碎冰上。

14、用Tris緩沖液溶解DNA。

15、加緩沖液后，為了加速DNA溶解，可以輕輕晃動或輕彈試管。

16、加入緩沖液后，置于4度過夜，也可以溶解DNA

17、將DNA溶液65度溫育10分鐘，可以滅活DNase。

18、在抽提過程中如果水相和有機層的界面不太清楚，說明其中蛋白質(zhì)含量較高，可增加酚/氯仿抽提的次數(shù)或適當延長離心的時間。

19、酚抽提時如果上清液太粘稠，無法進行水相轉(zhuǎn)移時，可加入適量TES稀釋后再抽提。

基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進行基因結(jié)構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學方式：異硫氰酸胍法,堿裂解法3生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等

試驗步驟：

1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。

2、細胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h，5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預冷無水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。

外周血DNA提取技術

分離外周血白細胞提取方法： 試驗步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。

3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細胞，－80?C凍存。試驗要求： 血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA： 試驗試劑： Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最后加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。NaI提取法提取外周血白細胞基因組： 實驗步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻后加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

常用的外周血白細胞基因提取方法： 試驗原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉淀，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉(zhuǎn)動幾次，混勻反應液。

3、反應液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉(zhuǎn)動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復一次。室溫揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

真核細胞DNA的制備

一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構建等實驗。

根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。試劑準備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無水乙醇、75%乙醇 試驗步驟： 材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。4)60°C水浴1-3hr。

2、培養(yǎng)細胞處理：

1)將培養(yǎng)細胞懸浮后，用TBS洗滌一次。2)離心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍體積的裂解緩沖液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提?。?/p>

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數(shù)次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過夜。

植物組織中DNA的提取

試驗原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術的關鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經(jīng)過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的預冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來。

植物DNA的SDS提取法： 試驗試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9、1mol／LHCl。10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液［濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標準液：取標準DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標準溶液。

實驗步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液［提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最后的作用濃度為50～70μg/ml，并在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法： 試驗步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉(zhuǎn)移到加有7ml經(jīng)預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min。

4、將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000rpm離心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺上吹干。

9、將風干的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μlTE溶液中于-20℃保存。

細菌DNA的提取方法

針對一些不易于提取的細菌的方法: 試驗試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇 70%乙醇 試驗步驟：

1、抽提緩沖液65℃預熱。

2、加菌體到已經(jīng)預熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12,000rpm，離心10min。

5、重復再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。較為常用的細菌DNA提取方法： 實驗步驟：

1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法： 第一種方法： 試驗步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min。

7、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，風干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二種方法： 試驗步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，風干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

石蠟包埋DNA提取試驗方法

試驗原理：

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎上改良和演變而業(yè)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術，是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進入含SDS和高濃度蛋白酶K（１mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分了生物學實驗。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進。首先通過組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。

試驗試劑：

配方：3mol/lNacl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，用HCL調(diào)PH值至7。0 石蠟消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l檸檬酸鈉，1%SDS，PH7.0。試驗步驟：

1、取蠟塊切片15-20張（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，離心3min，傾去二甲苯。重復3-4次，觀察管壁是否光滑。如果仍有蠟質(zhì)殘存，需繼續(xù)脫蠟。

2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室溫下放置30min，以10000rpm離心3min，去上清；再依次分別加入95%；75%；50%的乙醇重復上面的步驟。

3、消化：以1×SSC500μL加入SSC洗滌沉淀，以12000rpm離心3min。棄去上清夜，干燥沉淀。加入石蠟消化液400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃消化120h，第四天，補加PK10μl。

4、消化后的液體很清亮，肉眼可見的組織較少。將其轉(zhuǎn)入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以滅活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷卻。以10000rpm，離心5min。

5、取上清加等量的酚-氯仿，輕顛倒混勻呈乳白色。低溫下以14000rpm，離心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重復上面的步驟。

6、取上清加入預冷的兩倍體積的無水乙醇及1/10的乙酸鈉（PH5.2），顛倒混勻。置于-20℃，30min。低溫下以14000rpm，離心10min，去上清。

7、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌2次，（顛倒eppendorf管數(shù)次）以14000rpm，離心5min，自然干燥沉淀。

8、加TE20μl，（含RNA酶），4℃下過夜。注意事項：

1、取材時應避免出血壞死的組織，盡可能選用新鮮的標本。

2、消化時應不時震搖離心管，使酶與組織充分接觸。

3、福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，勻漿的效果往往不理想，可將組織切成10um的薄片進行消化。

4、消化不完全，可采用高濃度蛋白酶K及延長消化時間。附：elz氏DNA提取方法的主要步驟：

提取液的制備：500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS 500μg/ml蛋白酶ＫpH8.0

1、切除多余石錯，暴露組織。將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱重。

2、溶于TE9提取液(組織<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混懸2－3min，于48℃放置24h。

3、再次混懸組織，加入蛋白酶Ｋ至終濃度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。

4、用等體積酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍體積乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9000rpm離心１h。

5、沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

適用于PCR研究的快速提取法： 試驗步驟：

1、田間剪取植株新鮮葉片5－10mg（約2cm長）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號貼上相應的標簽。

2、用剪刀將葉片組織剪細（約0.5cm長）放在點穴式研板中。加入400μlDNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細，直到液體變成深綠色即可。

3、加400μlDNA提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的15ml離心管（貼上相應的編號）。

4、加400μl氯仿，混合均勻后，2400轉(zhuǎn)離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的15ml離心管（貼上相應的編號）。

5、加800μl無水乙醇，混勻，2400轉(zhuǎn)離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風干。用50μlTE緩沖液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。

Chelex-100法提取DNA： 試驗原理：

Chelex-100是一種化學螯合樹脂，由苯乙烯、二乙烯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親合力和螯合作用。在低離子強度、堿性及煮沸條件下，可以使細胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，DNA游離。Chelex-100特別適用于微量生物樣本的處理，方法簡便快速，提取過程始終在同一管中進行，不用轉(zhuǎn)移，可減少DNA的損失，操作步驟簡化，減少了污染的機會。

以血液為例實驗步驟：

1、取血液1-3?l，置1.5ml離心管中，加滅菌雙蒸水1ml，振蕩混勻，室溫30min，或置冰箱-20℃5min。2、10000r/min離心5min，棄上清，反復2-3次。

3、于沉淀中加入200?l懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴過夜。

4、振蕩5-10秒，置100℃5-10min，取出振蕩溶液5-10s。5、10000r/min5min，上清液即可作為PCR反應的DNA模板。注意事項：

1、Chelex-100處理模板僅適用于PCR反應，處理液不宜長期保存，如果保存的時間稍長，可將上清液轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆?。一般在一周?nèi)使用，如果保存時間過長則會影響PCR擴增結(jié)果。

2、在處理模板的各個步驟中，振蕩要充分。

3、煮沸的溫度、時間要充分，否則將影響擴增。

4、使用前要混勻離心，取上清液作為模板，如果PCR反應體系中含有Chelex-100，Mg2+會被螯合，降低酶活性，使PCR擴增失敗。

硅珠法提取DNA： 試驗原理： 在高濃度的硫氰酸胍存在的條件下，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附，當沒有硫氰酸胍存在時，DNA又可從二氧化硅中釋放出來。硫氰酸胍是一種高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)及一些不溶的物質(zhì)除去。吸附后的漂洗過程則可將溶液中的PCR抑制物洗去。

試驗試劑：

1、吸附劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.8ml0.5mol/LEDTA，0.5mlTritonX-100。

2、漂洗劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

3、硅珠懸浮液：0.06gSilica溶于1ml滅菌超純水。

4、TES：1ml1mol/LTris-HClpH8.0，2ml5mol/LNaCl，2ml0.5mol/LpH8.0EDTA，95ml滅菌超純水。

試驗步驟：

1、取1.5ml離心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混勻，煮沸5min。

2、振蕩混勻，加入300-600?l吸附液，混勻。

3、加入20-40?l硅珠懸浮液，振蕩混勻，置室溫15min，振蕩5s，10000r/min離心2min。

4、除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分懸浮沉淀物，10000r/min離心1min。

5、去上清液，重復漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min5min。

6、去乙醇，置56℃ 10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋渦混合30s，56℃保溫10min。7、10000r/min離心10min，上清液可直接用于PCR反應。固相吸附法提取DNA： 試驗原理：

硫氰酸胍具有溶解細胞和滅活核酸酶的性質(zhì)，利用當硫氰酸胍存在時硅藻顆粒能特異性吸附DNA，而當去除硫氰酸胍時，DNA又能從硅藻上釋放出來的特性，來提取樣本中的DNA。該方法尤其適用于臨床標本的DNA提取。

試驗試劑：

1、裂解液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4，2.2ml0.2mmol/LEDTApH8.0，0.3mlTritonX-100。

2、洗滌液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4。試驗步驟：

1、取100?l樣品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振蕩混合，10000r/min離心1min，去上清。

2、加1ml洗滌液，懸浮沉淀洗滌，10000r/min離心1min，再重復一次。加1ml70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃ 10min。

3、加60?lTE緩沖液混勻，56℃ 10min，10000r/min離心5min，上清液備用.DNA含量的檢測和純化

DNA含量的檢測：

一種方法是通過凝膠電泳的方法檢測DNA的含量：取2-5?lDNA溶解液與0.4?l6×載樣緩沖液混合，用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5?g/ml)檢測。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結(jié)構中，嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，這種熒光強度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比，通過比較樣品與標準品的熒光強度，對樣品中的DNA進行定量。（詳見凝膠電泳）另一方法是分光光度法，組成DNA的堿基，具有一定的吸收紫外線的特性，其最大吸收值在波長250-270之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外線的特性沒有改變，核酸的最大吸收波長為260nm，利用DNA的這個物理特性來測定DNA的濃度。

分光光度法的具體方法是：

1、取兩只清潔的比色杯，各加入2ml0.1mol/LNaOH校正零點。

2、以其中的一只比色杯作為空白對照，在另一只比色杯中加入4?lDNA溶液，再加入0.1mol/LNaOH至2ml混勻。

3、測定波長為260nm時的OD值，再將波長調(diào)至280nm測其OD值。

4、根據(jù)OD260=1時，雙鏈的DNA濃度為50?g/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40?g/ml，按計算公式：樣品DNA濃度(?g/ml)=OD260×40?g/ml×稀釋倍數(shù)，計算樣品的DNA濃度。

DNA純化：

首先利用瓊膠電泳將不同分子量的DNA片段分開,將某一特定分子量區(qū)域的瓊膠切下,利用DNAextractionkit將DNA從瓊膠中溶出并濃縮。（可參考質(zhì)粒DNA的純化）實驗材料： 1、6Xgel-loadingde:15%Ficoll400,0.25%bromophenolblue,0.25%xlenecanol紫外光箱

2、DFBuffer

3、WashBuffer

4、ElutionBuffer:10mMTris-HCl(pH8.5)

5、DFColumn 6、2mlCollectionTube 實驗步驟：

1、將欲分離之DNA混合物以0.7%瓊膠電泳分離。

2、電泳后,將瓊膠置於紫外光箱上觀察,把含有欲純化之DNA片段的瓊膠部位切下。

3、將步驟B的瓊膠以藍色微量吸管盡可能戳碎。

4、加入500mlDFbuffer,55oC作用10分鐘,每2-3分鐘搖晃數(shù)次,直至瓊膠完全溶解。

5、將步驟D瓊膠溶液全部吸入DFColumn,并套上CollectionTube(收集過濾液)。6、8000rpm離心1分鐘,將過濾液倒掉。加入500mlWashBuffer,8000rpm離心1分鐘,過濾液倒掉。14000rpm離心2分鐘。

7、將DFColumn轉(zhuǎn)移至上另一乾凈的微量離心管.加入15mlElutionBuffer,室溫靜置2分鐘。8、14000rpm離心2分鐘,微量離心管內(nèi)之液體即為純化的DNA片段。

9、取0.5ml純化的DNA加入4.5mlDDW及1ml6xDNAloadingde,跑0.7%瓊膠電泳,與marker比較,估計DNA的濃度。

第三篇：以Chelex100為介質(zhì)抽提DNA解析

以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA

近年來，DNA的分析技術已廣泛地應用于腫瘤學的研究中。獲取DNA的傳統(tǒng)方法是以新鮮、-70℃或液氮保存的標本為材料，通過蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提而獲取DNA。1987年，F(xiàn)ey等［1］首先用NP40成功地從骨髓涂片中提取到較高分子量的DNA，用于Southern印跡分析。國內(nèi)的一些學者［2,3］也用相似的方法，從骨髓涂片中提取到DNA。但這兩種方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步驟，操作復雜，費時。同時，需要在多個離心管之間轉(zhuǎn)移，增加了標本間的交叉污染。由于PCR技術對DNA樣品的純度和分子量的要求相對較低：對微量的DNA即可擴增，且只需待擴增的靶序列完整即可，不要求高分子量。因此，部分降解的DNA均可作PCR檢測。由于PCR有極高的敏感度，需嚴格控制標本間的交叉污染，同時為了適應血液系統(tǒng)惡性腫瘤標本來源的特點，我們通過與常規(guī)酚、氯仿提取DNA進行比較，以了解以Chelex 100為介質(zhì)提取DNA對PCR的影響。

一、材料和方法

1.細胞：(1)細胞株：B-NHL細胞株-村林細胞。(2)外周血有核細胞：由健康志愿者提供。

2.DNA獲取率比較：(1)將不同培養(yǎng)瓶中已培養(yǎng)的村林細胞混合；A組取10份，5 ml/份；B組取10份，0.5ml/份。(2)A組用酚、氯仿抽提DNA ：按Sambrook等［4］介紹的方法提取DNA。(3)B組用Chelex 100為介質(zhì)提取DNA：將已培養(yǎng)定量的村林細胞加入Eppendorf管中，加去離子水1ml，間歇振蕩30 分鐘。15 000r/min離心5分鐘，棄去上清液470 μl，加10% Chelex 100 170 μl，56℃溫育30分鐘。超速振蕩15秒，沸水浴8分鐘，15 000 r/min離心5分鐘，上清液即為DNA模板［5］。(4)DNA定量：在微量紫外分光光度計上分別測兩種不同方法提取DNA的吸光度(A，曾稱光密度OD)值，換算出DNA的濃度和獲得量：

DNA濃度(μg/ml)=OD260 ×50×稀釋倍數(shù)

DNA獲得量(μg)=DNA濃度×DNA溶液體積(5)統(tǒng)計學處理：采用兩樣本均數(shù)檢驗法進行檢驗。

［4］

3.PCR敏感性比較：(1)外周血有核細胞DNA的提?。喊碨ambrook等方法用酚、氯仿提取。(2)實驗分組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細胞DNA與外周血有核細胞DNA混合為A組；以酚、氯仿抽提的村林細胞DNA與外周血有核細胞DNA混合為B組，使村林細胞DNA含量分別為5%、1%、0.5%、0.3%、0.2%和0.1%。(3)PCR擴增：取1μgDNA，選用IgH基因重排引物，按Trainor等［6］方法進行Semi-nest擴增。(4)取PCR產(chǎn)物15 μl于8%聚丙烯酰胺凝膠200V電泳2小時，EB染色，紫外燈下觀測，拍照。本實驗重復3次。

4.PCR準確性的比較：(1)PCR擴增：分別以Chelex 100法和酚、氯仿法抽提的50ng DNA為模板，進行擴增，方法同前。(2)SSCP檢測：按Yap等方法進行［7］。(3)銀染：1%硝酸浸泡5分鐘，去離子水沖洗2次；0.2%硝酸銀浸泡3～5分鐘，去離子水沖洗2次；3%無水碳酸鈉顯影至條帶清晰而背景不至過深，10%乙酸浸泡5分鐘，停止反應。風干后拍照。重復3次。

5.血紅蛋白對PCR敏感性的影響：(1)以Chelex 100 為介質(zhì)提取村林細胞DNA：方法同前。(2)用健康志愿者外周血10 μl，按以Chelex 100 為介質(zhì)抽提DNA的方法和過程，對其進行處理。(3)用酚、氯仿抽提外周血有核細胞DNA：方法同前。(4)用微量紫外分光光度計測DNA的含量：方法同前。A組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核細胞DNA稀釋。PCR擴增時模板加量分別為1 μg。B組：以Chelex 100為介質(zhì)抽提的村林細胞DNA按5%、1％、0.5%和0.3%的比例用外周血有核細胞DNA稀釋。PCR擴增時的模板加量也為1 μg，但同時加5 μl的本節(jié)實驗步驟2處理后的上清液。(5)PCR擴增、電泳、染色及拍照：同前。本實驗重復3次。

二、結(jié)果

1.兩種不同方法提取DNA時的獲取率：酚、氯仿抽提組:5ml村林細胞的DNA的平均獲取量為82.4 μg±1.04 μg。Chelex 100組，0.5ml村林細胞的DNA的平均獲取量9.10 μg±2.84 μg。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，t值為0.899 5，P=0.380 25，兩組間的差異無顯著性。

2.兩種不同DNA提取方法PCR敏感性的比較：用以Chelex 100為介質(zhì)抽提的DNA進行PCR擴增時，其可檢測的最低含量為0.3%，即3ng/1 μg。用酚、氯仿抽提的DNA進行PCR擴增，其可檢測的最低含量為0.2%，即2ng/1 μg(1)。

1～6:稀釋度分別為0.1％、0.2%、0.3%、0.5%、1%、5%，M：Marker Marker左側(cè)為以Chelex 100為介質(zhì)抽提組，右側(cè)為酚、氯仿抽提組 1 兩種不同方法抽提DNA后梯度稀釋、PCR擴增結(jié)果

3.兩者不同DNA提取方法的PCR準確性的比較：結(jié)果顯示單鏈位置無差異，表明以Chelex 100為介質(zhì)抽提的DNA進行PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)SSCP及銀染后與經(jīng)酚、氯仿抽提的無差異。

4.血紅蛋白的存在對PCR敏感性的影響：實驗結(jié)果顯示，兩組PCR擴增產(chǎn)物條帶在紫外燈下亮度無差異，表明，用Chelex 100 為介質(zhì)抽提DNA時，紅細胞的存在與否，不影響PCR的敏感性（2）。

1～4:稀釋度分別為0.3%、0.5%、1%、5%；M:Marker;Marker左側(cè)為不含血組,右側(cè)為含血組 含血與不含血標本PCR擴增結(jié)果

三、討論

在有關分子生物學的研究中，DNA提取的方法很多，但由于操作步驟多易污染，所用的有機溶劑對人體有害，且標本量要求多，保存要求高；或者由于DNA的獲取量少，且有PCR擴增的抑制因素的存在，使PCR擴增的結(jié)果不穩(wěn)定［5］，嚴重影響了該方法在某些方面的應用。

Chelex 100 做為一種離子螯合劑，由苯乙烯和苯二乙烯組成。其懸液在堿性環(huán)境(pH 10-11)和100℃的條件下，可導致細胞膜的破裂和DNA的變性并釋放出來［5］。本實驗通過對兩種不同抽提DNA進行PCR擴增的方法的比較，發(fā)現(xiàn)以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA時，DNA的獲取率與經(jīng)典的酚、氯仿抽提法的無差異。這是由于前一方法雖然存在DNA釋放得是否完全以及仍有一部分由于高溫而降解的問題［8］，但酚、氯仿抽提時由于抽提過程中含有DNA的水相在轉(zhuǎn)移過程中不可避免地要損失一部分，使得DNA的獲取率也降低，導致二者在DNA的獲取率方面差異無顯著性。

此外，本實驗結(jié)果還表明，用此方法抽提DNA進行PCR擴增的閾值高于經(jīng)典的酚、氯仿抽提法的：閾值分別為0.3%和0.2%，而忠實性無影響。DNA在［8］100℃的條件下，可發(fā)生大量的降解，Sepp等研究證明，沸水浴處理后，所得的DNA的片段在200 bp以下，且量少。這主要是由于標本中的金屬離子在高溫和低離子強度的條件下對DNA降解的催化作用所致［5］。而在有Chelex 100存在的條件下，金屬離子被結(jié)合，阻止了其對DNA降解的催化作用，同時，由于Chelex 100 的顆粒在離心后沉淀下來，不會干擾PCR反應體系中的Mg2+濃度，且借助于PCR反應體系中緩沖液，其堿性的上清液也不會影響到PCR的擴增反應。但是，由于高溫本身也有一定程度降解DNA的作用，使得該方法提取的DNA片段在1 000 bp以下［8］，其中可含有低于80bp的小片段，也可出現(xiàn)DNA片段斷裂在PCR擴增的靶序列區(qū)域內(nèi)。這使得有效的靶序列的拷貝數(shù)減少，導致了用以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA進行擴增的方法的閾值稍高于酚、氯仿抽提法的閾值，而PCR的忠實性無影響。

再者，本實驗中，兩種不同DNA抽提方法在用梯度稀釋進行敏感度檢測時的敏感度分別為0.3%(3ng/1 μg)和2%(2ng/1 μg)。由于0.1 μg外周血單個核細胞DNA約含有104個不同的重鏈基因，上述敏感度分別相當于1 000個外周血有核細胞中可檢出3個和2個腫瘤細胞。

另外，在含血的標本中，血紅蛋白去除不徹底，其中的卟啉化合物可抑制PCR擴增。在酚、氯仿抽提時，由于蛋白質(zhì)被去除，也可通過預先去除紅細胞，使得卟啉化合物得到去除或明顯減少。而在以Chelex 100為介質(zhì)抽提DNA時，由于未用蛋白酶K消化，卟啉化合物很少從血紅蛋白中釋放出來，且可能還可以通過與Chelex 100結(jié)合，使得PCR擴增不受影響［5］，本實驗的結(jié)果證實了這一點。

由于此方法獲取的DNA的片段小于1 000 bp，故不能用于擴增靶片段大于1 000 bp的PCR實驗中，也不適用于Southern雜交中，應引起注意。

作者單位：200092 上海第二醫(yī)科大學附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)血液／腫瘤科（步嶸、王耀平）；上海鐵道大學醫(yī)學院附屬甘泉醫(yī)院檢驗科（葉元康）

參考文獻

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(收稿：1998-08-15 修回：1999-07-23)

第四篇：RNA抽提知識

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實驗樣品

如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點一無所知，當樣品稍微有一點復雜時，抽提RNA的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時提醒的是：沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當真的了。

3：實驗樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個問題非常重要，應該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個簡單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個細胞；我的建議是，樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎，會比較合理的。不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復雜且不徹底，導致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考慮后續(xù)實驗，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實驗樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時，還得考慮大量的樣品可能也會帶來大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴重，含量大打折扣，所以取樣時應該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細胞的結(jié)構，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅硬，普通的勻漿器根本無法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細菌 Trizol雖然對細胞的裂解效果出眾，但是對細菌堅韌的細胞壁還是無可奈何，這時我們可以利用超聲來輔助破壁。將細菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補至1ml。3)酵母 酵母細胞跟細菌一樣，還是因為細胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點就不用擔心這步有RNA降解的問題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實驗，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞郑x用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實驗！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對待的，但對于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實驗的操作難點，一定要謹慎，萬不可混入有機相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實際操作中，有的雜質(zhì)也會與RNA一起被醇沉淀下來，尤其是當其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機大分子及一些鹽，當濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。在不影響后續(xù)實驗的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實驗樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過，導致會殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因為這些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點決定了它們往往是非常強的酶抑制劑，對后續(xù)實驗影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來且影響后續(xù)實驗的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個方法優(yōu)點是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒有遇到這種方法處理不了的），缺點是成本比較高。對與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會很低，而且基本看不見沉淀物，這也會給后續(xù)的操作帶來很大的麻煩，進一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來，又不會影響后續(xù)實驗。不要迷信試劑說明書里的標準方法；有時，使用標準方法碰到問題在標準方法中是找不到答案的，要具體問題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點：首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當RNA沉淀比較大時 ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時是能看見管底的白色沉淀，但還是有時候是看不見的，即使是加過Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒看見不等于沒有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時仔細觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒問題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應盡快保存在-70℃，避免反復凍融，同時注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應該是酶殘留導致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，不可全信。目前實驗室用于正式實驗前檢測RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時電泳還可以用于估計核酸的濃度，其準確度與經(jīng)驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關。NANO-Drop檢測的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進行NANO-Drop檢測和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）

第五篇：DNA抽提試劑盒簡介

一．上海生工的試劑盒：

1.基因組小量抽提試劑盒

BS47350Extractions350元BBI

BS474100Extractions420元BBI

SK125150次280元Sangon

SK1252100次380元Sangon

基本說明：通過將組織細胞裂解后，以RnaseA和Proteinase K消化降解RNA和蛋白質(zhì)。然后經(jīng)過簡單抽提、沉淀獲得基因組DNA。本試劑盒適用于從人或動物的血液、培養(yǎng)細胞、各種組織、Gram+/Gram-細菌中快速抽提基因組DNA。

主要特點：1.整個抽提過程30分鐘，氯仿抽提僅一次，無需酚抽提。

2.本試劑盒抽提DNA能用于幾乎所有生物學實驗。

3.按樣品準備方法得到的200微升樣品中可獲得2~10微克DNA。

2.UNIQ-10柱式血液基因組抽提試劑盒

BS48350Extractions390元BBI

BS484100Extractions760元BBI

SK126150次380元Sangon

SK1262100次690元Sangon

基本說明：UNIQ-10柱含有特異性吸附DNA的膜。利用最新研發(fā)的血液處理試劑，能特異有效地將血液中白細胞的DNA釋放到溶液上清中，有利于膜對血液基因組DNA的吸附。經(jīng)洗滌除去非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，然后用Elution Buffer洗脫。試用于從人和動物外周血貨其他途徑收集的血液中抽提基因組DNA。

主要特點：1.抓們針對血液基因組DNA的抽提。

2.DNA純度好，產(chǎn)率高。

3.快速、簡便。