第一篇：基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料與儀器、用品.........................................................................................................................2 2 原理與方法......................................................................................................................................3

2.1 獲取目的基因.......................................................................................................................3

2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5

2.2.1 核酸電泳....................................................................................................................5 2.2.2 膠回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子體外連接.............................................................................................................7 2.4 轉(zhuǎn)化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒.......................................................................................................................8 3 討論...............................................................................................................................................10 3.1試劑.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸電泳緩沖液...............................................................................................................11 3.4 膠回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位點(diǎn)..................................................................................................................11 3.6 轉(zhuǎn)化效率............................................................................................................................11 3.7 試劑盒................................................................................................................................12 參考文獻(xiàn)...........................................................................................................................................13 致謝....................................................................................................................錯(cuò)誤！未定義書簽。附錄....................................................................................................................................................14

Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10

3.1 Reagent................................................................................................................................11

3.2 Nuclease..............................................................................................................................11

3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11

3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11

3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11

3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11

3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10

引言

自噬是一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的生命活動(dòng)，該活動(dòng)對(duì)于動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。自噬相關(guān)基因LC3通過(guò)與細(xì)菌質(zhì)粒結(jié)合可以大量復(fù)制。質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。不同微管之間的差異，主要與結(jié)合于微管的非微管結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，它們參與微管結(jié)構(gòu)的組裝，維持微管的穩(wěn)定LC3和微管與其他骨架纖維之間的連接，表現(xiàn)為廣泛的功能性作用，該類蛋白被統(tǒng)稱為微管相關(guān)蛋白，LC3即微管相關(guān)蛋白輕鏈3，作為動(dòng)物機(jī)體的一個(gè)自噬相關(guān)基因，對(duì)于其自噬活動(dòng)相關(guān)微管蛋白質(zhì)表達(dá)具有重要意義，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該基因研究逐步增多、不斷深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 調(diào)控對(duì)巨噬過(guò)程是至關(guān)重要的,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)LC3-II定位自噬前體和自噬小體,它被認(rèn)為是一個(gè)自噬標(biāo)記，在其對(duì)兩性哈德氏腺的實(shí)驗(yàn)中，免疫印跡分析顯示了LC3-I和LC3-II兩個(gè)對(duì)應(yīng)波段[1]；Hanqing Dong等的發(fā)現(xiàn)表明,LC3 結(jié)合可能發(fā)生在脂滴表面,導(dǎo)致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候選識(shí)別是脂滴-相關(guān)蛋白質(zhì)；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章敘述了選擇性自噬最有特性的基質(zhì)是p62,它也被稱為死骨片1 / SQSTM1，p62是廣泛表達(dá)的細(xì)胞蛋白質(zhì),在動(dòng)物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通過(guò)LC3-作用區(qū)域p62直接與LC3相互作用[3]。此次實(shí)習(xí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將該基因作為目的基因，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成為相關(guān)研究、實(shí)驗(yàn)的組成環(huán)節(jié)，例如用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)檢驗(yàn)，以及動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)控制研究、自噬研究等。

質(zhì)粒是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子，即細(xì)胞附殖粒、又稱胞附殖粒。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中，總體多為原核生物。構(gòu)建重組質(zhì)粒指將目的基因，即外源基因，與具有自主復(fù)制能力的載體在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，隨后抽提質(zhì)粒可以將目的基因與細(xì)菌DNA分離，以獲得高純度的目的基因。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)、實(shí)際動(dòng)手操作，完成了此質(zhì)粒的構(gòu)建和抽提過(guò)程，并在文中闡述了獲取目的基因后而進(jìn)行的LC3基因克隆過(guò)程，其中使用GFP、RFP載體構(gòu)建質(zhì)粒。基因克隆又稱為分子克隆，指采用重組DNA技術(shù)，將不同來(lái)源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接，組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個(gè)雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子的過(guò)程。其是七十年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有革命性的研究技術(shù)，可簡(jiǎn)要敘述為分、切、連、轉(zhuǎn)、選五個(gè)步驟。其最終目的在于通過(guò)相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)爰闹骷?xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)目的基因被大量的復(fù)制，即把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來(lái)，構(gòu)成了一個(gè)重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌中，建立基因克隆體系。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含GFP-RFP-LC3基因的重組質(zhì)粒，GFP、RFP分別為綠色和紅色熒光基因；使用的T載體為克隆載體，符合基因工程的載體應(yīng)具有的基本性質(zhì)，包括在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，使外源重組的DNA片段得以擴(kuò)增；分子量小，利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段，且在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破

[2]

壞；載體分子中具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記，以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征；載體具有較多的限制酶單一切點(diǎn)，為避開(kāi)外源DNA片段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。

細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過(guò)程，目前，國(guó)內(nèi)外提取RNA的技術(shù)均比較成熟，生產(chǎn)出的有關(guān)試劑盒利用分子量比較大的有機(jī)溶劑氯仿使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離，初步獲取RNA，并進(jìn)一步分離純化。提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，即可獲得用于重組質(zhì)粒的目的基因。重組質(zhì)粒過(guò)程中利用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳等方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是利用DNA片段旁側(cè)兩個(gè)短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，它應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過(guò)雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬(wàn)倍。從非常微量的DNA甚至單個(gè)細(xì)胞所含有的DNA起始，可產(chǎn)生微克量的PCR產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。重組質(zhì)粒構(gòu)建后，使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)采取的離心法抽提質(zhì)粒，即去除 RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開(kāi)，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。最后將得到的質(zhì)粒送至有關(guān)生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析表明，目的基因片段存在于送檢樣品中，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并獲取了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒。材料與儀器、用品

鴨肝臟組織，液氮，75%酒精，無(wú)水乙醇，氯仿，蒸餾水，普通雙蒸水，瓊脂糖，50倍濃度商品化TAE，2000bpDNA標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker），填充劑（Loading）,氨芐霉素，LB培養(yǎng)液，E.coli DH5a 菌株。

美國(guó)Omega RNA提取試劑盒，包含HiBin微型制備管，2毫升收集管，RNA-Solv試劑，RNA Wash 緩沖液 I，RNA Wash 緩沖液 II，DEPC水等。

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑盒中的試劑包括小量制備 制備管, 2毫升 微量離心管,1.5毫升 微量離心管, RNA酶 A, 緩沖液 S1, 緩沖液 S2,緩沖液 S3,緩沖液 W1, 緩沖液 W2 濃縮液，Eluent洗脫液。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑盒中試劑包括緩沖液 W1，緩沖液 W2濃縮液，緩沖液 DE-A，緩沖液 DE-B，Eluent洗脫液。

RNA引物混合液，包含模版RNA，隨機(jī)引物，無(wú)RNA酶雙蒸水等。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包含模版RNA引物變性溶液，隨機(jī)引物，5倍濃度M-MLV 緩沖液，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，RNA酶M-MLV，無(wú)RNA酶雙蒸水。

一次性口罩，一次性手套，實(shí)驗(yàn)工作服，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機(jī)，研缽，移液器，槍頭，無(wú)DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制備管，離心機(jī)，恒溫水浴鍋，振蕩器，冰盒，酒精燈，蒸餾設(shè)備和用品（50毫升燒杯，蒸餾頭，100℃溫度計(jì)，冷凝管，接引管，三角瓶，鐵夾，鐵環(huán)，酒精燈，沸石，50m量筒，鐵架臺(tái)），PE管，PCR儀，錐形瓶，微波爐，水平電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，記號(hào)筆，衛(wèi)生紙，玻璃涂棒。原理與方法

2.1 獲取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是將細(xì)胞破碎裂解，利用一些試劑去除多糖、酚類、蛋白和DNA的污染，通過(guò)一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終得到純凈的RNA的過(guò)程。影響RNA提取質(zhì)量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶無(wú)處不在，包括破碎細(xì)胞內(nèi)的RNA酶,實(shí)驗(yàn)室空氣、實(shí)驗(yàn)臺(tái)上的酶，實(shí)驗(yàn)所用試劑中的酶,實(shí)驗(yàn)人員身上攜帶的酶以及實(shí)驗(yàn)器材的污染等等，而且RNA酶性質(zhì)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)室很難做到完全隔離這個(gè)酶的作用[4]。RNA提取試劑盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因?yàn)镽NA樣品中易殘留RNA酶的變性劑異硫氰酸胍和β-巰基乙醇，細(xì)胞裂解不徹底，導(dǎo)致核糖核酸不能完全釋放出來(lái)。另外，有些細(xì)菌的細(xì)胞壁堅(jiān)韌，一般溫和的破壁方法很難將其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。

本實(shí)驗(yàn)使用美國(guó)Omega RNA提取試劑盒。實(shí)驗(yàn)前，酒精充分消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)、實(shí)驗(yàn)室空氣，戴棉手套取適量液氮置于保溫瓶中，將用酒精沖洗過(guò)的研缽泡入液氮中，同時(shí)將鴨的肝組織泡入液氮中，待兩者充分冷凍，在研缽中研碎鴨肝組織。

操作步驟包括取適量組織粉末置于無(wú)DNA酶和RNA酶的收集管中，離心，5000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，4℃。加1毫升RNA-Solv試劑，振蕩混勻，室溫孵化3分鐘。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv與組織混合液加0.2 毫升氯仿），蓋好管蓋，用手劇烈振蕩15秒，冰上孵育10分鐘。隨后4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后混合物分三層，RNA存在于最上層水相。將五分之四的RNA水層置于新的收集管，加三分之一收集管的無(wú)水乙醇。輕微混勻并離心后，小心吸出不大于700 微升的上層RNA水層液體于無(wú)RNA酶的制備管中，振蕩混勻沉淀，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。重復(fù)上一步驟，再次離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。將制備管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 緩沖液 I，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 緩沖液 II，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液，隨后用空收集管離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，2分鐘，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器將離心管內(nèi)殘余的液體吸出，打開(kāi)管蓋，將沉淀于超凈臺(tái)上晾5分鐘；或?qū)⒀b有沉淀的管子蓋緊蓋子后，放進(jìn)一次性手套中，然后打開(kāi)管蓋，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分鐘。最后洗提RNA，將制備管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，確保加入到制備管中央，隨后室溫靜置2分鐘，離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃。得到的RNA保存在超低溫冰箱。2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶催化,以dNTP為原料，合成DNA的過(guò)程，是DNA

生物合成的一種特殊方式。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成，合成的DNA鏈稱為與RNA互補(bǔ)DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過(guò)程[

6、7]。

操作步驟包括收集管中配制模版RNA引物混合液，為6微升體系，包含模版RNA2微升，隨機(jī)引物1微升，無(wú)RNA酶雙蒸水3微升。70℃保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。離心數(shù)秒種使模版RNA引物的變性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，為10微升體系，包含上述模版RNA引物變性溶液6微升，隨機(jī)引物1微升，5倍濃度M-MLV 緩沖液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制劑0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，無(wú)RNA酶雙蒸水0.75微升。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用隨機(jī)引物，所以先于30℃恒溫水浴鍋保溫10分鐘，然后42℃保溫60分鐘。70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA做好標(biāo)記并保存于超低溫冰箱。2.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，它的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是利用DNA在體外95℃高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制以得到多量脫氧核糖核酸[

9、10]。

本實(shí)驗(yàn)第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增cDNA為DNA,目的是判斷哪一對(duì)引物擴(kuò)增效果好，選擇其進(jìn)行DNA擴(kuò)增。準(zhǔn)備步驟包括制作雙蒸水，首先取蒸餾水200 微升，于超凈臺(tái)點(diǎn)燃酒精燈，安裝設(shè)備對(duì)蒸餾水再次蒸餾，PE管分裝后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭雙手，禁用雙手觸碰PE管口。RNA引物獲取，是將目的基因送至博士生物公司，由其進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與合成；合成的引物經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥，呈薄膜狀附在離心管中，盛有引物的離心管經(jīng)過(guò)離心后開(kāi)啟，隨后加入規(guī)定量的雙蒸水合上管蓋充分振蕩使其溶解，備用。

操作步驟包括準(zhǔn)備四個(gè)PE管，并分別標(biāo)記為1-

1、1-

2、2-

1、2-2，將兩對(duì)引物分別加入兩個(gè)模版中，配制25微升體系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，雙蒸水11微升。將所有PE管振蕩，并瞬時(shí)離心一次，使管壁沒(méi)有殘留混合液，隨后擺到雙面板上；使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RNA擴(kuò)增，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，設(shè)置運(yùn)行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，4℃、保存時(shí)長(zhǎng)，循環(huán)30次。

2.2 回收目的基因

2.2.1 核酸電泳

核酸電泳，其中利用了瓊脂糖凝膠，瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度[11]。將凝膠置電場(chǎng)中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過(guò)凝膠網(wǎng)孔向陽(yáng)極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場(chǎng)、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當(dāng)時(shí)間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度為200bp至50kb的DNA[12]，一般來(lái)說(shuō)，需要分離的目的基因片段越大，瓊脂糖濃度越小，凝膠密度越小，反之亦然。樣品加入量加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過(guò)多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散。每孔點(diǎn)樣的體積一般少于25微升，吸取每一個(gè)樣品時(shí)，操作需謹(jǐn)慎，沒(méi)有顏色的樣品需要加入填充劑。另外，電泳系統(tǒng)須加入適宜DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定，過(guò)大或過(guò)小的標(biāo)準(zhǔn)參照物姐不利于判定結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳準(zhǔn)備步驟包括核酸用瓊脂糖凝膠制作，配制1%的瓊脂糖凝膠，首先稱取1.000g瓊脂糖加入錐形瓶中，倒入100毫升電泳緩沖液TAE(50倍濃度TAE20毫升加1升水，混勻)，搖晃混勻后用封口膜封住瓶口后在微波爐內(nèi)加熱兩三分鐘，在水龍頭上沖涼冷卻至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此過(guò)程中注意自身防護(hù)。同時(shí)用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子，將配好的瓊脂糖凝膠液體倒入電泳槽，凝固約20分鐘。溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊，倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。

將完全凝固的瓊脂糖凝膠放置在加有緩沖液的電泳槽，緩沖液一定要沒(méi)過(guò)凝膠，由負(fù)極到正極電泳；瓊脂糖加樣時(shí)用移液搶將樣品加至點(diǎn)樣孔，動(dòng)作穩(wěn)重注意不要戳破凝膠導(dǎo)致濾液，點(diǎn)樣是每孔加50微升樣品混合液，標(biāo)準(zhǔn)參照物加10微升；接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120A，電壓為120V，開(kāi)始電泳；約20分鐘后樣品跑到五分之四凝膠寬度，取出電泳膠，觀察結(jié)果，以確定擴(kuò)增目的基因引物為第一對(duì)或第二對(duì)(圖1)。

圖1 引物選擇PCR結(jié)果

Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 膠回收

cDNA擴(kuò)增引物選擇結(jié)果顯示引物2的擴(kuò)增效果較引物1好，因此選擇引物2進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。加入第二對(duì)引物進(jìn)行第二次的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA并回收產(chǎn)物，擴(kuò)增使用高保真的連接酶。配制50微升體系，每管加入緩沖液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，雙蒸水24.3微升，隨后將PE管振蕩，并瞬時(shí)離心一次，使管壁沒(méi)有殘留；使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RNA擴(kuò)增，運(yùn)行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，10℃、保存時(shí)長(zhǎng)，循環(huán)40次。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，配膠過(guò)程同上，點(diǎn)樣時(shí)，每孔加50微升樣品混合液和5微升Loading，然后接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120Ma，電壓為120V，開(kāi)始電泳。約20分鐘跑膠完成，觀察結(jié)果（圖2）。為對(duì)瓊脂糖凝膠電泳的某一核酸條帶做進(jìn)一步分析，可對(duì)DNA進(jìn)行膠回收

[

13、14]。

圖2 cDNA擴(kuò)增結(jié)果

Figure 2 cDNA amplification results 本實(shí)驗(yàn)使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段切膠回收。準(zhǔn)備步驟包括緩沖液 W2濃縮液中加入一定體積的無(wú)水乙醇，原因是此為第一次使用凝膠回收試劑盒。準(zhǔn)備無(wú)核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。準(zhǔn)備75℃水浴。試用前，檢查緩沖液 DE-B是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)應(yīng)于70℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括戴上防護(hù)帽在紫外燈下切下含有目的基因的DNA的瓊脂凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，用加入凝膠后稱量重量減去提前記錄的1.5毫升離心管重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積。加入3個(gè)凝膠體積的緩沖液 DE-A，混合均勻后于75℃加熱，每而兩三分鐘間斷混合，直至凝膠完全融化。加0.5個(gè)緩沖液 DE-A體積的緩沖液 DE-B，混合均勻。吸取上一步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管，制備管置于2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加500毫升 緩沖液 W1，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加700毫升 緩沖液 W2，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。以同樣的方法加700毫升緩沖液 W2洗滌一次，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。將制備管置于潔凈的1.5毫升離心管中，在制備膜中央加30微升 Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，洗脫DNA。得到的DNA保存至超低溫冰箱。2.3 DNA分子體外連接

本實(shí)驗(yàn)采用卡那霉素抗性T載體連接，此步驟即重組DNA分子，為目的基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞并復(fù)制的必要條件。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步:首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物;然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h過(guò)夜，這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

T載體連接操作時(shí)，首先于小PCR管中配制50微升體系，包括Solution I 5微升，回收產(chǎn)物4.5微升，T載體0.5微升。隨后混勻并于16℃連接過(guò)夜，連接時(shí)間至少8小時(shí)。2.4 轉(zhuǎn)化

外源 DNA 與載體分子的連接即為 DNA 重組技術(shù)，這樣重新組合的 DNA 分子叫做重組子。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過(guò)抗生素篩選法篩選出重組子，并可通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶酶切，電泳，根據(jù)DNA Maker標(biāo)準(zhǔn)判斷陽(yáng)性重組子中是否含有目的基因。感受態(tài)細(xì)胞制作原理為細(xì)菌在0°C氯化鈣低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)[15]。轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，即原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法[16]?；蚩寺≈械霓D(zhuǎn)化過(guò)程原理為質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)42°C短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而鑒別選擇出轉(zhuǎn)化子。

準(zhǔn)備步驟包括配制LB培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、含抗生素LB培養(yǎng)基。首先，每升LB培養(yǎng)基，需在超純水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，溶解混勻；LB固體培養(yǎng)基是在每升LB培養(yǎng)基中加入15克瓊脂糖，混勻加熱溶解；制作含氨芐霉素培養(yǎng)基，稱量固體LB微波爐加熱3分鐘，沖冷水至不燙手，按1：1000比例加入氨芐霉素，倒薄薄的一層于培養(yǎng)皿中，待其凝固，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，倒置并標(biāo)記。

操作步驟包括準(zhǔn)備冰盒，打開(kāi)42℃水恒溫浴鍋，將無(wú)抗LB提前放入37℃預(yù)熱；從超低溫冰箱取出E.coli DH5a 感受態(tài)菌株，將商品化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞快速且溫柔取于冰中，待其于冰中融化；在超凈工作臺(tái)作業(yè)，吸取10微升載體連接產(chǎn)物，緩慢加入感受

態(tài)中，反復(fù)抽吸三次混勻，動(dòng)作需輕微，防止產(chǎn)生氣泡，放入冰盒30分鐘；將樣品放入42℃中熱激90秒，此為轉(zhuǎn)化必須環(huán)節(jié)；冰浴2分鐘，使其停止轉(zhuǎn)化過(guò)程；將預(yù)熱的無(wú)抗LB8微升加入樣品中，放入搖床45分鐘至60分鐘，復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞；將涂菌棒用酒精燈滅菌，從冰箱取出培養(yǎng)基放入37℃溫箱預(yù)熱；將搖好后的樣品4000g離心5分鐘，棄去上清600微升，余200微升，目的是使得細(xì)菌濃度升高，將剩余200微升樣品混勻，加到培養(yǎng)板上，用滅菌放涼的涂菌棒涂勻；涂菌后的培養(yǎng)基保存于37℃恒溫箱過(guò)夜。

培養(yǎng)大腸桿菌，在培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過(guò)夜，長(zhǎng)出的菌落呈乳白色大圓點(diǎn)狀菌，表面和背面顏色一致，菌落邊緣整齊均勻，表面光滑濕潤(rùn),分散分布于整個(gè)培養(yǎng)皿（圖3）。隨后挑菌、搖菌、獲得菌液，用于篩選、抽提鑒定質(zhì)粒。挑菌時(shí)在細(xì)菌間超凈工作臺(tái)作業(yè)，取10只試管標(biāo)號(hào)，依次擺到試管架上，灼燒試管蓋和鑷子，用鑷子拔下試管蓋后，在此灼燒試管口和試管蓋，倒入約三分之一的氨芐抗性LB，用鑷子夾槍頭挑去細(xì)菌，連同槍頭扔進(jìn)試管，灼燒管口和試管口，在火焰中蓋上試管蓋。搖菌是在37℃搖床，過(guò)夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。

圖3 轉(zhuǎn)化后大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果

Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒

質(zhì)粒是在細(xì)菌細(xì)胞中染色體之外能夠自主復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀雙螺旋的分子或遺傳因子。質(zhì)粒抽提原理即去除 RNA，且將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開(kāi)，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒[

17、18]。

本實(shí)驗(yàn)采用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒。

準(zhǔn)備步驟包括RNA酶 A全部加入緩沖液 S1中并4℃貯存。準(zhǔn)備無(wú)核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。緩沖液 W2濃縮液中加入指定體積的無(wú)水乙醇，原因是第一次使用試劑盒。試用前，檢查緩沖液 S2是否出現(xiàn)沉淀，如有沉淀應(yīng)于37℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括取2毫升在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄盡上清。加250微升緩沖液 S1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需要均勻，不能夠有小的菌塊，確認(rèn)緩沖液W2中已加入無(wú)水乙醇。加250毫升，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的和中的中和，降低溶菌效率。避免劇烈搖晃，否則可能導(dǎo)致基因組DNA的污染，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。采用離心法純化質(zhì)粒，吸取上一步驟中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回離心管，加500微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回2毫升離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘。將制備管移入新的1.5毫升離心管中，在制備管中央加80 微升的Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，將Eluent或去離子水加熱至65℃能提高洗脫效率。隨后，質(zhì)粒測(cè)序鑒定目的基因是否插入。菌液PCR后使用隨機(jī)引物進(jìn)行通測(cè)，引物合成及測(cè)序由北京華大生物公司完成（圖4、5）。

圖4 質(zhì)?；蚪M堿基序列

Figure 4 Plasmid genome base sequence

圖5 質(zhì)粒基因組測(cè)序峰

Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 討論

本文構(gòu)建的目的基因LC3有關(guān)自噬活動(dòng)，近年來(lái)，自噬在癌癥免疫因素感染炎癥和神經(jīng)退行性變等領(lǐng)域的研究不斷增加，準(zhǔn)確地檢測(cè)自噬基因?qū)τ谘芯孔允傻纳飳W(xué)功能至關(guān)重要，根據(jù)LC3的特點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，從而獲取大量LC3基因可作為自噬研究的組成環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)采用反轉(zhuǎn)錄的方法獲取cDNA后，依據(jù)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳效果顯示第二對(duì)引物擴(kuò)增的條帶比較清晰,由此選擇第二對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到相應(yīng)目的基因。采用T載體連接方法，將目的基因引入感受態(tài)大腸桿菌，進(jìn)行基因克隆。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，將轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、測(cè)序等進(jìn)一步鑒定。轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)約600bp的明亮條帶,為目的基因條帶，說(shuō)明目的基因成功導(dǎo)入細(xì)菌質(zhì)粒并復(fù)制，進(jìn)一步的基因測(cè)序鑒定結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)完成了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建。最后使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，得到多量目的基因LC3。

整個(gè)過(guò)程的每個(gè)環(huán)節(jié)中皆包含影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，各個(gè)因素稍有變化既可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成量或質(zhì)的影響，現(xiàn)將需要注意的幾個(gè)重要因素及其影響討論如下： 3.1試劑

試劑使用前應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書。如用于提取RNA的Omega RNA提取試劑盒，其中的緩沖液 W2 濃縮液在提取開(kāi)始或貯存在室溫條件前，必須用無(wú)水乙醇稀釋，如果使用了未經(jīng)處理濃縮液，則無(wú)法充分洗滌RNA，使得最后產(chǎn)物中存在大量雜質(zhì)。3.2 核酸酶

注意保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶量最小化，操作過(guò)程應(yīng)迅速且謹(jǐn)慎，始終戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶到試管或污染用具；避免在操作中說(shuō)話聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、異丙醇等應(yīng)采用未開(kāi)封的新瓶，使用專門配制的無(wú)RNA酶制備管、收集管。酶如果沒(méi)有被充分隔絕，將減少甚至提取不出RNA。3.3 核酸電泳緩沖液

瓊脂糖核酸電泳的緩沖系統(tǒng)在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的選擇和濃度，而且不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。

DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響，凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，否則將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照不準(zhǔn)。3.4 膠回收效率

將凝膠切成細(xì)小的碎塊可大大縮短凝膠融化時(shí)間，從而提高回收率；勿將含DNA的凝膠長(zhǎng)時(shí)間地暴露在紫外燈下，減少紫外燈對(duì)DNA造成的損傷；融化凝膠時(shí)應(yīng)當(dāng)完全，避免殘留降低回收率，以及阻塞制備管濾膜影響后續(xù)步驟也會(huì)降低回收效率。3.5 DNA酶切位點(diǎn)

基因克隆時(shí)選擇載體DNA酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)注意兩個(gè)酶切位點(diǎn)的距離不應(yīng)過(guò)小，否則影響限制性內(nèi)切酶識(shí)別切點(diǎn)；目的基因片段內(nèi)部不應(yīng)含有所選的酶切位點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)后繼應(yīng)用的所有載體都盡可能含有所選的酶切位點(diǎn)，并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克?。20]；選擇較常用的酶切位點(diǎn)，兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上3個(gè)堿基；使用酶切效率高，且雙酶切有共同緩沖液的酶。3.6 轉(zhuǎn)化效率

為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液；細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制，DH5α菌株的OD600 為0.5 時(shí),這時(shí)比較合適，密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度方面應(yīng)注意用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA 的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低，1納克的超螺旋態(tài)DNA 即可使50微升的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和，一般情況下,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的二十分之一[

18、19]。

試劑的質(zhì)量方面應(yīng)注意所用的試劑,如氯化鈣等均需是最高純度的，并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處；防止雜菌和雜DNA 的污染，整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管,Tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染[20], 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。3.7 試劑盒

本實(shí)驗(yàn)使用了若干試劑盒，例如AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、美國(guó)Omega RNA提取試劑盒，使操作能夠擺脫繁重的試劑配制及優(yōu)化過(guò)程，試劑盒中配備有相應(yīng)使用說(shuō)明書，按照說(shuō)明書不需或只需少量的優(yōu)化即可得到滿意的結(jié)果，使用試劑盒時(shí)要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要選取專用提取試劑盒，如果不是專用試劑盒，提出的RNA不能確保其質(zhì)量以及完整性，會(huì)影響RT-PCR、基因克隆、抽提質(zhì)粒等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] Vega-Naredo, Beatriz Caballero, et al.Sexual dimorphism of autophagy in Syrian hamster Harderian gland culminates in a holocrine secretion in female glands.Landes Bioscience 2009;30:785-92.[2] Hanqing Dong and Mark J.Czaja, et al.Regulation of lipid droplets by autophagy.Cell 2005;19:2066-8.[3] Noboru Mizushima1 and Masaaki Komatsu.Autophagy: Renovation of Cells and Tissues.Dev Cell 2011;6:463-77.[4]鄒曉蕾,劉禮崔,羅立新.細(xì)菌總RNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代食品科技,2013,08:1948-1954.[5]淳俊,鄭彥峰,王勝華,陳放.一種廣泛適用的RNA提取方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,05:591-597.[6] 張濤，韓梅等.人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,08:34-37.[7] 邱建明,董澤平等.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-套式PCR方法檢測(cè)腎綜合征出血熱病人血清中的漢坦病毒特異性RNA[J].病毒學(xué)報(bào),1997,02:23-29.[8]黃銀花,胡曉湘等.影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素[J].傳,2003,01:65-68.金科華,劉潔.[9]段新華,劉誠(chéng)明.關(guān)于PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2004,04:294-298.[10] 潘力,崔翠等.一種用于PCR擴(kuò)增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2010,03:450-453.張濤,韓梅,劉翠晶,胥苗苗.[11]梅魁敏,伍學(xué)州等.用ELISA法和核酸電泳法檢測(cè)牛輪狀病毒[J].微生物學(xué)通報(bào),1991,06:366-367.[12]劉淑華.核酸電泳法檢測(cè)輪狀病毒(摘要)[J].青海醫(yī)藥雜志,1986,02:29.[13]吳淑珍,夏露等.用PCR-PAGE切膠回收-PCR測(cè)序法制備DXS9898基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,05:460-461+463.[14]徐珍,張玉芹等.不同酶切體系對(duì)膠回收純化DNA濃度的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,09:54-57.[15]李明才,何韶衡.一種高效、快速的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,04:228-230+241.[16]羅鋒,余騰等.感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化冰浴時(shí)間對(duì)大腸埃希菌轉(zhuǎn)化效率的影響[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,03:82-85.[17]金科華，劉潔等.質(zhì)粒抽提策略對(duì)雙酶切鑒定的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,06:559-561.[18]李鈞敏,邊才苗.幾種細(xì)菌質(zhì)粒抽提方法的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2004,05:9-12+114.[19]封建凱,孫萬(wàn)邦等.重組hIL-10質(zhì)粒構(gòu)建及其在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)和純化[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,03:168-172.[20]盧鈞雄.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C端重組質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué),2012.附錄

附錄1：離心力和離心轉(zhuǎn)速換算計(jì)算公式

RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相對(duì)離心力，單位為g N表示轉(zhuǎn)速，單位為rpm（轉(zhuǎn)/分）R表示離心半徑，單位為cm。

本實(shí)驗(yàn)使用的離心機(jī)離心力和離心轉(zhuǎn)速換算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf

附錄2：試劑穩(wěn)定性

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

RNA酶 A，室溫可以貯藏6個(gè)月，長(zhǎng)期貯存于-20℃；緩沖液 S1為細(xì)菌懸浮液，加入RNA酶 A后，混合均勻，4℃貯存；緩沖液 S2為細(xì)菌裂解液，室溫密閉貯存；緩沖液 S3為中和液，室溫密閉貯存；緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2為濃縮液或去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存。的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2 為濃縮液，又稱去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-A為凝膠融化劑，含DNA保護(hù)劑，防止DNA在高溫下降解，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-B為結(jié)合液，室溫密閉貯存。

第二篇：質(zhì)粒抽提常見(jiàn)問(wèn)題與解答

1.沒(méi)有提出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒收獲量很低

A菌種老化

建議：對(duì)于甘油保存的菌種，需要先進(jìn)行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，并對(duì)菌種進(jìn)行初搖活化，按照1:500的比例進(jìn)行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)時(shí)間最好不要超出16小時(shí)(或者OD600不超過(guò)3.0)。

B低拷貝質(zhì)粒

建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量。

C質(zhì)粒丟失

建議：某些質(zhì)粒在次繼代培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。

D裂解不充分

建議：如果采用超過(guò)推薦量的菌體進(jìn)行質(zhì)粒制備，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分。可適當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。

EBuffer中有沉淀未溶解

建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀，使用前請(qǐng)檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請(qǐng)置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建議：按照說(shuō)明書要求加入要求量的無(wú)水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。另外對(duì)于質(zhì)粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請(qǐng)確保乙醇的體積不小于70%。

G離心柱中乙醇?xì)埩?/p>

建議：漂洗后，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，盡量去除殘留的乙醇。另外對(duì)于質(zhì)粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹片刻(或置于65℃烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

H洗脫液加入位置不正確

建議：洗脫液應(yīng)加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。

I洗脫液pH值不正確

建議：將DNA從柱子上洗脫下來(lái)的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會(huì)顯著影響洗脫效果，請(qǐng)使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進(jìn)行洗脫，如果用ddH2O進(jìn)行洗脫，請(qǐng)確保pH在7.0-8.5之間。

J洗脫體積的選擇

建議：洗脫體積將會(huì)影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會(huì)降低。請(qǐng)使用試劑盒推薦的洗脫體積進(jìn)行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請(qǐng)減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，請(qǐng)根據(jù)試劑盒要求進(jìn)行二次洗脫，再用推薦的方法進(jìn)行沉淀，濃縮質(zhì)粒。

K洗脫時(shí)間的選擇

建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。

2.質(zhì)粒純度不高

A蛋白質(zhì)污染

建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測(cè)定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來(lái)稀釋。

BRNA污染

建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應(yīng)該存放在4℃，如果存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者沒(méi)有正確存放，RNaseA活力下降，請(qǐng)重新加入RNaseA。

C基因組DNA污染

建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時(shí)間最好不要超過(guò)5分鐘。

D菌株為含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株

建議：請(qǐng)選用含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株質(zhì)粒DNA提取試劑盒，或者轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到不含內(nèi)源核酸酶宿主菌株中。

3.加樣時(shí)DNA飄出加樣孔外

原因：柱中殘留乙醇未除干凈。

建議：洗脫質(zhì)粒DNA前確保無(wú)乙醇?xì)埩粼谥由??？稍匐x心或者抽真空。

第三篇：質(zhì)粒DNA抽提實(shí)驗(yàn)報(bào)告

質(zhì)粒DNA抽提實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.掌握堿裂解法小量快速提取質(zhì)粒DNA的方法，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切，PCR擴(kuò)增等。

2.學(xué)習(xí)利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測(cè)DNA的純度，構(gòu)型，含量和分子量大小。

二．實(shí)驗(yàn)原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DN結(jié)果A的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。三．實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：

1.5mlEP管、高速離心機(jī)、移液槍

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．實(shí)驗(yàn)步驟:

1、取1.5ml細(xì)胞培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1min，去上清液（重復(fù)一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重懸浮細(xì)胞

3、加200μl溶液Ⅱ，輕輕搖勻，放置5min

4、加150μl溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min

5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min

6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min 7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存?zhèn)溆?/p>

五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果：得到大腸桿菌質(zhì)粒DNA

PCR以及電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一．實(shí)驗(yàn)原理：

PCR：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來(lái)進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。

二．實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：

EP管、離心機(jī)、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測(cè)儀等 DNA模板、與特定DNA模板結(jié)合的引物、去離子水、商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠

三．PCR反應(yīng)體系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步驟 1、94℃預(yù)變性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循環(huán)7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循環(huán)23次 3、72℃，10s

4、電泳檢測(cè)

五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表：

如右圖所示：實(shí)驗(yàn)所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實(shí)驗(yàn)的DNA條帶位置在500bp-750bp之間，接近500bp，證明實(shí)驗(yàn)是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 實(shí)驗(yàn)組

對(duì)照組

第四篇：重組質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)~~~

昨天我在版中我看很多谷友詢問(wèn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建問(wèn)題，有些谷友說(shuō)構(gòu)建質(zhì)粒需要一個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這讓我聯(lián)想我剛做分子生物學(xué)時(shí)候的曲折。重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實(shí)只是最基本的方法，一般一個(gè)星期同時(shí)構(gòu)建三二個(gè)組質(zhì)粒是沒(méi)有問(wèn)題的。在國(guó)內(nèi)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，也大都是由實(shí)驗(yàn)員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來(lái)一線工作時(shí)的經(jīng)驗(yàn)積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實(shí)驗(yàn)中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下： 1)克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題 2)載體酶切的問(wèn)題 3)連接片段濃度比的問(wèn)題 在闡明上述問(wèn)題同時(shí)，本人盡可能舉些實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題案例予以說(shuō)明。

一、克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題

1、克隆位點(diǎn)選擇的問(wèn)題。首先要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對(duì)照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。這是常識(shí)，不贅述。

2、保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但是保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會(huì)大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進(jìn)行；而有一類，僅僅只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DNA片段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個(gè)保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個(gè)。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護(hù)堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾選用NdeI克隆位點(diǎn)，未注意到保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入NdeI酶切位點(diǎn)后，只加上兩個(gè)保護(hù)堿基，一個(gè)月內(nèi)沒(méi)有進(jìn)展，始終不能成功構(gòu)建重組載體。后查文獻(xiàn)得知癥結(jié)所在，在NdeI序列后加上六個(gè)保護(hù)堿基后，迎刃而解。大家引以為戒啊?，F(xiàn)在普通酶我都引入三個(gè)保護(hù)堿基。現(xiàn)在堿基合成價(jià)格也不貴了，為保證酶切充分，連接順利，不用節(jié)約那點(diǎn)錢，再說(shuō)若一次不成功，重復(fù)實(shí)驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間與金錢更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。

二、載體酶切的問(wèn)題

1、質(zhì)粒的單酶切鑒定。這個(gè)問(wèn)題似乎很簡(jiǎn)單，但我認(rèn)為很有著重強(qiáng)調(diào)之必要?，F(xiàn)在大家手頭的質(zhì)粒都是轉(zhuǎn)來(lái)轉(zhuǎn)去的，其中的各酶切位點(diǎn)狀況如何，是否能被有效地切開(kāi)，這些問(wèn)題都是要核實(shí)的。因此，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前必須對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行單酶切鑒定?，F(xiàn)在我每次構(gòu)建之前，對(duì)所選擇的克隆位點(diǎn)都要作一一鑒定，例如選擇NdeI和HindIII作為克隆位點(diǎn)，就先分別對(duì)質(zhì)粒上這兩個(gè)酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切鑒定。單酶切鑒定能有效地切開(kāi)后，再發(fā)出引物合成定單，進(jìn)行引物合成；若不能，就按“一”中原則進(jìn)行調(diào)換。

2、連接反應(yīng)的對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)中，這步驟屬于質(zhì)粒載體與外源DNA片段的連接反應(yīng)。成功與否，很大程度上取決于與質(zhì)粒和DNA片段的酶切效果。一般情況下，都在通用緩沖液中進(jìn)行雙酶切，但這兩種酶在通用緩沖液中酶切效率不一樣，這可能導(dǎo)致部分的單缺口的質(zhì)粒片段存在，這樣，在連接反應(yīng)中，即使在外源DNA片段存在下，這種單缺口的質(zhì)粒片段能夠進(jìn)行更快速有效自我連接。最終結(jié)果是大量假陽(yáng)性的菌斑生長(zhǎng)。對(duì)照連接反應(yīng)中，在不加入外源片段情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果有菌斑生長(zhǎng)，說(shuō)明雙酶切不充分，質(zhì)粒DNA必須重新進(jìn)行雙酶切。實(shí)驗(yàn)案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，直接就做連接，未上述兩步鑒定，每次結(jié)果滿板的菌斑。但就是沒(méi)有陽(yáng)性。后來(lái)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單酶要鑒定后，發(fā)現(xiàn)XhoI酶切位點(diǎn)損壞。又是一個(gè)月沒(méi)有進(jìn)展，浪費(fèi)精力和藥品。血的教訓(xùn)啊。因?yàn)楫?dāng)時(shí)沒(méi)有注意到：?jiǎn)吻匈|(zhì)粒是一條帶，雙切質(zhì)粒也是一條帶，電泳行為上是一樣的，分辨不出。如果做上述任何一個(gè)鑒定就會(huì)知道問(wèn)題出在那兒，呵呵。實(shí)驗(yàn)案例分析3：本實(shí)驗(yàn)室一個(gè)號(hào)稱實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇蟛┦?，用KpnI和HindIII構(gòu)建重組質(zhì)粒，一個(gè)月未果，只得陰性斑，不得陽(yáng)性斑，后懷疑KpnI酶失效。遷怒KpnI，在我不知情下扔掉實(shí)驗(yàn)室所有KpnI酶。我得知后，問(wèn)他做過(guò)上述兩鑒定實(shí)驗(yàn)后，他支吾著說(shuō)沒(méi)有，后經(jīng)鑒定HindIII位點(diǎn)失效。最后他責(zé)備本人暗中保留一手，沒(méi)

有傾攮相授。呵呵，他不自責(zé)自己不思考，只是木著腦袋做實(shí)驗(yàn)，反倒咬一口解鈴人，再說(shuō)我在那以前也不知道他遇到什么難題。呵呵，你說(shuō)冤不冤？這世道啊!也可看出，實(shí)驗(yàn)室人員之間相互交流相當(dāng)重要。兩星期前寫了前兩問(wèn)題后，終于能抽時(shí)間寫第三個(gè)問(wèn)題，在做好前述兩個(gè)方面工作后，這個(gè)問(wèn)題相對(duì)簡(jiǎn)單。

三、連接時(shí)兩片段濃度比問(wèn)題 一般實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)上都說(shuō)質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實(shí)際操作中我以為在1：5甚至1：10為宜。做好“

一、二”，16℃ 10小時(shí)后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺(jué)態(tài)問(wèn)題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時(shí)代公司”的產(chǎn)品，感覺(jué)還不錯(cuò)（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個(gè)估測(cè)處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測(cè)，也可以電泳對(duì)比marker估測(cè)，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法： 1． 取一平皿。

2． 薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4 ℃可以存一個(gè)星期)。3．平皿背面可以畫成小方格。4． 一小格中點(diǎn)1 ul樣品。5． 另一小格格點(diǎn)1 ul DNA標(biāo)準(zhǔn)品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相當(dāng)60 ng)6． 涼干后，紫外燈下根據(jù)亮度就可以估測(cè)了。OK，我連接時(shí)這么估測(cè)濃度，5分鐘就要可以知道兩片段濃度。其實(shí)連接片段濃度比可以充許在一個(gè)范圍內(nèi)，1：5至1：10都可以，所以上述估測(cè)方法在這種情況下是行得通的。

第五篇：轉(zhuǎn)化方法和酵母質(zhì)粒抽提

酵母轉(zhuǎn)化（快速）

侯昕

1、挑單菌落于3ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)至菌濃度為2X108 cell/ml。（約18h）。

2、用1.5ml離心管收集菌液兩次，每次1ml，13500rpm，常溫離心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一種后，要吸打混勻。5、6、42°C水浴1－3小時(shí)。

13500rpm離心1分鐘，吸棄上清。沉淀中加500ul水，吸打均勻，100ul涂皿。

7、30°C培養(yǎng)兩天

此方法可用于已知蛋白互做檢測(cè)，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鮭魚精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低溫放置過(guò)夜，滅

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母轉(zhuǎn)化（高效）

侯昕

1、挑酵母單菌落于100ml SC液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X107 cell/ml（稀釋20倍，OD545或OD600為0.1）?！蛱艚湍竼尉溆?0ml 2XYPAD液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X108cell/ml（稀釋200倍，OD545或OD600為0.1）。

2、用兩個(gè)50ml離心管分別收集40ml菌液，3000g，常溫離心5分鐘。

3、將菌分別轉(zhuǎn)入兩瓶150ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌濃度為2X107cell/ml。

4、用500ml離心管收集300ml菌液，3000g，5分鐘。用 200mlddH2O洗兩次，將菌轉(zhuǎn)入一個(gè)50ml離心管。

5、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均勻。

8、42°C水域熱激45分鐘；每5分鐘搖一下，使其受熱均勻。

9、3000g，離心5分鐘，棄上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均勻，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母雙雜交文庫(kù)篩選，建議分步轉(zhuǎn)化。

酵母質(zhì)粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，離心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙簽打散。

3、加200ul 苯酚氯仿異戊醇（25：24：1），搖5分鐘，13000rpm，離心5分鐘。

4、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，重復(fù)3。

5、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，搖勻，10000g，4°C離心10－30分鐘。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，離心5－10分鐘。

7、重復(fù)6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的質(zhì)?？捎糜陔娹D(zhuǎn)大腸桿菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA