第一篇：pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的構(gòu)建研究論文

應(yīng)激蛋白Argonaute1是一種多功能蛋白，參與RNA干擾及應(yīng)激顆粒(SGs)、加工體(PBs)形成等多種細(xì)胞生物學(xué)過程。pmCherry-C1是一種可以編碼紅色熒光蛋白的真核表達載體。2015年9～11月，本研究通過基因工程技術(shù)將Argonaute1基因片段連接至pmCherry-C1載體，構(gòu)建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒，旨在為深入研究Argonaute1蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能提供便利工具。

1材料與方法

1.1材料質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞:pmCherry-C1載體由JohanPerane博士饋贈，感受態(tài)大腸桿菌Trans1購自天津科儀嘉欣科技有限公司，HeLa細(xì)胞來自本實驗室。酶類及主要生化試劑:限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA連接酶均購自ThermoFisherScientific公司，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，T/A載體(pEASY-T1)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┧鱽韺毧萍加邢薰?，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司，LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購于KPL公司?？贵w:兔抗人Argonaute1單克隆抗體購自CST公司，鼠抗人G3BP單克隆抗體和兔抗人DCP1α抗體購自abcam公司，鼠抗人櫻桃紅蛋白(Cherry)單克隆抗體購自MBL公司，藍色熒光(AlexaFluor350)標(biāo)記的驢抗鼠熒光二抗和綠色熒光(AlexaFluor488)標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠和抗兔IgG二抗購自KPL公司。引物合成及基因測序由北京天一輝遠公司完成。

1.2pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1Argonaute1蛋白目的片段獲取提取HeLa細(xì)胞的總RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列進行Argonaute1的cDNA擴增;根據(jù)CDS序列(NM012199.2)設(shè)計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反轉(zhuǎn)錄的Argonaute1cDNA為模板，擴增PCR目的片段，條件為95℃預(yù)變性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15個循環(huán)，每次循環(huán)降低1℃，再以50℃進行20個循環(huán)，72℃延伸10min;將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將目的片段與pEASY-T1(T/A載體)于25℃連接15min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Tran1-T1感受態(tài)細(xì)胞，置于含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

1.2.2線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體獲取以質(zhì)粒快速小提試劑盒提取pmCherry-C1質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，完整切下呈線性的pmCherry-C1質(zhì)粒載體，以1%瓊脂糖電泳分離，再以凝膠回收試劑盒回收pmCherry-C1線性載體(約4700bp)。在T4DNA連接酶作用下，將線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下連接并過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌大腸桿菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質(zhì)粒。

1.3pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒鑒定

1.3.1酶切及基因測序采用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1進行單、雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小;同時對重組質(zhì)粒進行基因測序鑒定。

1.3.2融合蛋白檢測采用Westernblotting法。以預(yù)冷的1×NP-40裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后4℃、12000r/min離心10min，取上清獲取全細(xì)胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、2.5%β-巰基乙醇)，99℃熱變性10min，8%SDS-PAGE電泳;以半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3h;加入兔抗人Argonaute1單克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育過夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗室溫孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物后暗室曝光。

1.3.3三色熒光共定位分析以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。將細(xì)胞接種于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達80%融合時，進行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48h給予0.5mmol/L亞砷酸鹽處理1h，以4%多聚甲醛室溫固定10min，以高壓過的PBS緩沖液洗滌2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室溫靜置通透10min;加入1%BSA封閉1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次;加入藍色熒光標(biāo)記驢抗鼠(1∶800)與綠色熒光標(biāo)記驢抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次。以不含DAPI的細(xì)胞熒光封片液封片并過夜，以激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紅、綠、藍三色熒光信號。

2結(jié)果

2.1Argonaute1目的片段PCR擴增目的片段長度約為2574bp。

2.2線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體完整的線性pm-Cherry-C1質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，在4722bp左右出現(xiàn)條帶，純化回收后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

2.3重組真核表達質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1鑒定結(jié)果

2.3.1酶切及基因測序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期相符，重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果正確，證明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位點上。

2.3.2融合蛋白表達Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量為89.7KDa，Westernblotting法檢測的蛋白條帶與目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表達成功。

2.3.3三色熒光共定位轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)熒光信號，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時Cherry-Argonaute1可在胞質(zhì)內(nèi)形成紅色的顆粒狀結(jié)構(gòu)，與SGs的標(biāo)志蛋白G3BP(藍色)、PBs的標(biāo)志蛋白DCP1α(綠色)顆粒結(jié)構(gòu)均呈共定位關(guān)系。

3討論

Argonaute1蛋白家族是一類相對分子量約為100KDa的序列保守蛋白，表達于人、果蠅、擬南芥等多個物種。Argonaute1蛋白家族包括多個成員，多含有月牙狀的PAZ和具有潛在核酸內(nèi)切酶活性的PIWI結(jié)構(gòu)域，參與miRNA、siRNA、piRNA等多個非編碼小RNA的細(xì)胞生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute1是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的核心元件，與siRNA生成、靶mRNA降解、細(xì)胞應(yīng)激等過程密切相關(guān)。生物體的生存環(huán)境復(fù)雜多變，機體細(xì)胞為應(yīng)對氧化應(yīng)激、滲透壓休克、熱休克、紫外線輻射和病毒感染等多種外界刺激而建立相應(yīng)的“應(yīng)激反應(yīng)體系”，以保持細(xì)胞旺盛的生命力。轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機制是其中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它可調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)RNA代謝、暫時抑制應(yīng)激細(xì)胞中蛋白的翻譯過程、節(jié)省細(xì)胞內(nèi)合成代謝的原料和能量、優(yōu)先表達應(yīng)激所特需的蛋白等。SGs和PBs是細(xì)胞受到應(yīng)激時在胞質(zhì)內(nèi)形成的與RNA代謝密切相關(guān)的顆粒狀結(jié)構(gòu)。這兩種顆粒結(jié)構(gòu)實質(zhì)上是一系列蛋白、核酸的聚集體。隨著研究的深入，不斷有新的應(yīng)激蛋白被發(fā)現(xiàn)。

其中，Argonaute1蛋白同時參與細(xì)胞中SGs和PBs的形成。通過基因工程的方法對Argonaute1蛋白進行熒光蛋白標(biāo)記，可用于探討Argonaute1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激中的作用。Cherry是四聚體Discosomasp.紅色熒光蛋白的一個突變體，熒光強度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1載體允許目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成紅色熒光標(biāo)記的目的蛋白。本研究通過構(gòu)建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的方法對Argonaute1蛋白進行Cherry的熒光標(biāo)記。在Westernblotting實驗中發(fā)現(xiàn)，利用抗內(nèi)源性Argonaute1抗體可以檢測出兩個條帶，而抗Cherry抗體檢測出一個條帶，表明pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒能夠在活細(xì)胞內(nèi)成功表達Cherry與Argonaute1的融合蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到亞砷酸鹽氧化應(yīng)激刺激時，Cherry標(biāo)記的Argonaute1蛋白可與應(yīng)激顆粒(以G3BP蛋白為標(biāo)記蛋白)和加工體(以DCP1α為標(biāo)記蛋白)均呈共定位關(guān)系，說明Argonaute1蛋白為細(xì)胞應(yīng)激和加工體的共同成員。

總之，本研究成功構(gòu)建了重組pmCherry-C1-Argonaute1質(zhì)粒，其可有效表達Cherry標(biāo)記的Argonaute1融合蛋白;上述結(jié)果有助于深入研究Argonaute1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激及相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的生物學(xué)作用機制。

第二篇：重組質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)驗~~~

昨天我在版中我看很多谷友詢問重組質(zhì)粒的構(gòu)建問題，有些谷友說構(gòu)建質(zhì)粒需要一個月，甚至更長時間，這讓我聯(lián)想我剛做分子生物學(xué)時候的曲折。重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實只是最基本的方法，一般一個星期同時構(gòu)建三二個組質(zhì)粒是沒有問題的。在國內(nèi)先進的實驗中，也大都是由實驗員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來一線工作時的經(jīng)驗積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實驗中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下： 1)克隆基因的酶切位點問題 2)載體酶切的問題 3)連接片段濃度比的問題 在闡明上述問題同時，本人盡可能舉些實驗中的問題案例予以說明。

一、克隆基因的酶切位點問題

1、克隆位點選擇的問題。首先要對目標(biāo)基因進行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。然后對照質(zhì)粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點。這是常識，不贅述。

2、保護堿基數(shù)目的問題。在設(shè)計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護堿基，這是大家所熟知的。但是保護堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會大大影響后續(xù)的實驗進展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進行；而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進行，這是因為內(nèi)切酶不能正常結(jié)合DNA片段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實驗設(shè)計。NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾選用NdeI克隆位點，未注意到保護堿基數(shù)目的問題，設(shè)計PCR引物時，引入NdeI酶切位點后，只加上兩個保護堿基，一個月內(nèi)沒有進展，始終不能成功構(gòu)建重組載體。后查文獻得知癥結(jié)所在，在NdeI序列后加上六個保護堿基后，迎刃而解。大家引以為戒啊。現(xiàn)在普通酶我都引入三個保護堿基?，F(xiàn)在堿基合成價格也不貴了，為保證酶切充分，連接順利，不用節(jié)約那點錢，再說若一次不成功，重復(fù)實驗花費時間與金錢更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。

二、載體酶切的問題

1、質(zhì)粒的單酶切鑒定。這個問題似乎很簡單，但我認(rèn)為很有著重強調(diào)之必要。現(xiàn)在大家手頭的質(zhì)粒都是轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去的，其中的各酶切位點狀況如何，是否能被有效地切開，這些問題都是要核實的。因此，在實驗開始之前必須對質(zhì)粒載體進行單酶切鑒定?，F(xiàn)在我每次構(gòu)建之前，對所選擇的克隆位點都要作一一鑒定，例如選擇NdeI和HindIII作為克隆位點，就先分別對質(zhì)粒上這兩個酶的酶切位點進行單酶切鑒定。單酶切鑒定能有效地切開后，再發(fā)出引物合成定單，進行引物合成；若不能，就按“一”中原則進行調(diào)換。

2、連接反應(yīng)的對照。在實驗中，這步驟屬于質(zhì)粒載體與外源DNA片段的連接反應(yīng)。成功與否，很大程度上取決于與質(zhì)粒和DNA片段的酶切效果。一般情況下，都在通用緩沖液中進行雙酶切，但這兩種酶在通用緩沖液中酶切效率不一樣，這可能導(dǎo)致部分的單缺口的質(zhì)粒片段存在，這樣，在連接反應(yīng)中，即使在外源DNA片段存在下，這種單缺口的質(zhì)粒片段能夠進行更快速有效自我連接。最終結(jié)果是大量假陽性的菌斑生長。對照連接反應(yīng)中，在不加入外源片段情況下，實驗結(jié)果如果有菌斑生長，說明雙酶切不充分，質(zhì)粒DNA必須重新進行雙酶切。實驗案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位點構(gòu)建重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行雙酶切后，直接就做連接，未上述兩步鑒定，每次結(jié)果滿板的菌斑。但就是沒有陽性。后來對質(zhì)粒進行單酶要鑒定后，發(fā)現(xiàn)XhoI酶切位點損壞。又是一個月沒有進展，浪費精力和藥品。血的教訓(xùn)啊。因為當(dāng)時沒有注意到：單切質(zhì)粒是一條帶，雙切質(zhì)粒也是一條帶，電泳行為上是一樣的，分辨不出。如果做上述任何一個鑒定就會知道問題出在那兒，呵呵。實驗案例分析3：本實驗室一個號稱實驗嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇蟛┦?，用KpnI和HindIII構(gòu)建重組質(zhì)粒，一個月未果，只得陰性斑，不得陽性斑，后懷疑KpnI酶失效。遷怒KpnI，在我不知情下扔掉實驗室所有KpnI酶。我得知后，問他做過上述兩鑒定實驗后，他支吾著說沒有，后經(jīng)鑒定HindIII位點失效。最后他責(zé)備本人暗中保留一手，沒

有傾攮相授。呵呵，他不自責(zé)自己不思考，只是木著腦袋做實驗，反倒咬一口解鈴人，再說我在那以前也不知道他遇到什么難題。呵呵，你說冤不冤？這世道啊!也可看出，實驗室人員之間相互交流相當(dāng)重要。兩星期前寫了前兩問題后，終于能抽時間寫第三個問題，在做好前述兩個方面工作后，這個問題相對簡單。

三、連接時兩片段濃度比問題 一般實驗指導(dǎo)手冊上都說質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實際操作中我以為在1：5甚至1：10為宜。做好“

一、二”，16℃ 10小時后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺態(tài)問題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時代公司”的產(chǎn)品，感覺還不錯（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個估測處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測，也可以電泳對比marker估測，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法： 1． 取一平皿。

2． 薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4 ℃可以存一個星期)。3．平皿背面可以畫成小方格。4． 一小格中點1 ul樣品。5． 另一小格格點1 ul DNA標(biāo)準(zhǔn)品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相當(dāng)60 ng)6． 涼干后，紫外燈下根據(jù)亮度就可以估測了。OK，我連接時這么估測濃度，5分鐘就要可以知道兩片段濃度。其實連接片段濃度比可以充許在一個范圍內(nèi)，1：5至1：10都可以，所以上述估測方法在這種情況下是行得通的。

第三篇：基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料與儀器、用品.........................................................................................................................2 2 原理與方法......................................................................................................................................3

2.1 獲取目的基因.......................................................................................................................3

2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5

2.2.1 核酸電泳....................................................................................................................5 2.2.2 膠回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子體外連接.............................................................................................................7 2.4 轉(zhuǎn)化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒.......................................................................................................................8 3 討論...............................................................................................................................................10 3.1試劑.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸電泳緩沖液...............................................................................................................11 3.4 膠回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位點..................................................................................................................11 3.6 轉(zhuǎn)化效率............................................................................................................................11 3.7 試劑盒................................................................................................................................12 參考文獻...........................................................................................................................................13 致謝....................................................................................................................錯誤！未定義書簽。附錄....................................................................................................................................................14

Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10

3.1 Reagent................................................................................................................................11

3.2 Nuclease..............................................................................................................................11

3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11

3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11

3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11

3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11

3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10

引言

自噬是一種實現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的生命活動，該活動對于動物機體生長發(fā)育具有重要意義。自噬相關(guān)基因LC3通過與細(xì)菌質(zhì)粒結(jié)合可以大量復(fù)制。質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。不同微管之間的差異，主要與結(jié)合于微管的非微管結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，它們參與微管結(jié)構(gòu)的組裝，維持微管的穩(wěn)定LC3和微管與其他骨架纖維之間的連接，表現(xiàn)為廣泛的功能性作用，該類蛋白被統(tǒng)稱為微管相關(guān)蛋白，LC3即微管相關(guān)蛋白輕鏈3，作為動物機體的一個自噬相關(guān)基因，對于其自噬活動相關(guān)微管蛋白質(zhì)表達具有重要意義，目前國內(nèi)外對該基因研究逐步增多、不斷深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 調(diào)控對巨噬過程是至關(guān)重要的,因為蛋白質(zhì)LC3-II定位自噬前體和自噬小體,它被認(rèn)為是一個自噬標(biāo)記，在其對兩性哈德氏腺的實驗中，免疫印跡分析顯示了LC3-I和LC3-II兩個對應(yīng)波段[1]；Hanqing Dong等的發(fā)現(xiàn)表明,LC3 結(jié)合可能發(fā)生在脂滴表面,導(dǎo)致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候選識別是脂滴-相關(guān)蛋白質(zhì)；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章敘述了選擇性自噬最有特性的基質(zhì)是p62,它也被稱為死骨片1 / SQSTM1，p62是廣泛表達的細(xì)胞蛋白質(zhì),在動物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通過LC3-作用區(qū)域p62直接與LC3相互作用[3]。此次實習(xí)實驗過程中，將該基因作為目的基因，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成為相關(guān)研究、實驗的組成環(huán)節(jié)，例如用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)檢驗，以及動物機體蛋白質(zhì)表達控制研究、自噬研究等。

質(zhì)粒是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子，即細(xì)胞附殖粒、又稱胞附殖粒。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中，總體多為原核生物。構(gòu)建重組質(zhì)粒指將目的基因，即外源基因，與具有自主復(fù)制能力的載體在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，隨后抽提質(zhì)?？梢詫⒛康幕蚺c細(xì)菌DNA分離，以獲得高純度的目的基因。筆者通過實驗學(xué)習(xí)、實際動手操作，完成了此質(zhì)粒的構(gòu)建和抽提過程，并在文中闡述了獲取目的基因后而進行的LC3基因克隆過程，其中使用GFP、RFP載體構(gòu)建質(zhì)粒?；蚩寺∮址Q為分子克隆，指采用重組DNA技術(shù)，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進行擴增，形成大量的子代分子的過程。其是七十年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可簡要敘述為分、切、連、轉(zhuǎn)、選五個步驟。其最終目的在于通過相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)爰闹骷?xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)目的基因被大量的復(fù)制，即把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌中，建立基因克隆體系。本實驗構(gòu)建含GFP-RFP-LC3基因的重組質(zhì)粒，GFP、RFP分別為綠色和紅色熒光基因；使用的T載體為克隆載體，符合基因工程的載體應(yīng)具有的基本性質(zhì)，包括在宿主細(xì)胞中有獨立的復(fù)制和表達的能力，使外源重組的DNA片段得以擴增；分子量小，利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段，且在實驗操作中也不易被機械剪切而破

[2]

壞；載體分子中具有兩個以上的容易檢測的遺傳標(biāo)記，以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征；載體具有較多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。

細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取實質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程，目前，國內(nèi)外提取RNA的技術(shù)均比較成熟，生產(chǎn)出的有關(guān)試劑盒利用分子量比較大的有機溶劑氯仿使有機相和無機相迅速分離，初步獲取RNA，并進一步分離純化。提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄并擴增，即可獲得用于重組質(zhì)粒的目的基因。重組質(zhì)粒過程中利用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳等方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是利用DNA片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，在體外快速擴增特異DNA片段的技術(shù)，它應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬倍。從非常微量的DNA甚至單個細(xì)胞所含有的DNA起始，可產(chǎn)生微克量的PCR產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。重組質(zhì)粒構(gòu)建后，使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒，本實驗采取的離心法抽提質(zhì)粒，即去除 RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。最后將得到的質(zhì)粒送至有關(guān)生物公司測序，測序結(jié)果分析表明，目的基因片段存在于送檢樣品中，說明實驗成功構(gòu)建并獲取了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒。材料與儀器、用品

鴨肝臟組織，液氮，75%酒精，無水乙醇，氯仿，蒸餾水，普通雙蒸水，瓊脂糖，50倍濃度商品化TAE，2000bpDNA標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker），填充劑（Loading）,氨芐霉素，LB培養(yǎng)液，E.coli DH5a 菌株。

美國Omega RNA提取試劑盒，包含HiBin微型制備管，2毫升收集管，RNA-Solv試劑，RNA Wash 緩沖液 I，RNA Wash 緩沖液 II，DEPC水等。

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑盒中的試劑包括小量制備 制備管, 2毫升 微量離心管,1.5毫升 微量離心管, RNA酶 A, 緩沖液 S1, 緩沖液 S2,緩沖液 S3,緩沖液 W1, 緩沖液 W2 濃縮液，Eluent洗脫液。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑盒中試劑包括緩沖液 W1，緩沖液 W2濃縮液，緩沖液 DE-A，緩沖液 DE-B，Eluent洗脫液。

RNA引物混合液，包含模版RNA，隨機引物，無RNA酶雙蒸水等。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包含模版RNA引物變性溶液，隨機引物，5倍濃度M-MLV 緩沖液，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，RNA酶M-MLV，無RNA酶雙蒸水。

一次性口罩，一次性手套，實驗工作服，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機，研缽，移液器，槍頭，無DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制備管，離心機，恒溫水浴鍋，振蕩器，冰盒，酒精燈，蒸餾設(shè)備和用品（50毫升燒杯，蒸餾頭，100℃溫度計，冷凝管，接引管，三角瓶，鐵夾，鐵環(huán)，酒精燈，沸石，50m量筒，鐵架臺），PE管，PCR儀，錐形瓶，微波爐，水平電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，記號筆，衛(wèi)生紙，玻璃涂棒。原理與方法

2.1 獲取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是將細(xì)胞破碎裂解，利用一些試劑去除多糖、酚類、蛋白和DNA的污染，通過一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終得到純凈的RNA的過程。影響RNA提取質(zhì)量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶無處不在，包括破碎細(xì)胞內(nèi)的RNA酶,實驗室空氣、實驗臺上的酶，實驗所用試劑中的酶,實驗人員身上攜帶的酶以及實驗器材的污染等等，而且RNA酶性質(zhì)穩(wěn)定，實驗室很難做到完全隔離這個酶的作用[4]。RNA提取試劑盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因為RNA樣品中易殘留RNA酶的變性劑異硫氰酸胍和β-巰基乙醇，細(xì)胞裂解不徹底，導(dǎo)致核糖核酸不能完全釋放出來。另外，有些細(xì)菌的細(xì)胞壁堅韌，一般溫和的破壁方法很難將其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。

本實驗使用美國Omega RNA提取試劑盒。實驗前，酒精充分消毒實驗臺、實驗室空氣，戴棉手套取適量液氮置于保溫瓶中，將用酒精沖洗過的研缽泡入液氮中，同時將鴨的肝組織泡入液氮中，待兩者充分冷凍，在研缽中研碎鴨肝組織。

操作步驟包括取適量組織粉末置于無DNA酶和RNA酶的收集管中，離心，5000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，4℃。加1毫升RNA-Solv試劑，振蕩混勻，室溫孵化3分鐘。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv與組織混合液加0.2 毫升氯仿），蓋好管蓋，用手劇烈振蕩15秒，冰上孵育10分鐘。隨后4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后混合物分三層，RNA存在于最上層水相。將五分之四的RNA水層置于新的收集管，加三分之一收集管的無水乙醇。輕微混勻并離心后，小心吸出不大于700 微升的上層RNA水層液體于無RNA酶的制備管中，振蕩混勻沉淀，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。重復(fù)上一步驟，再次離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。將制備管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 緩沖液 I，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 緩沖液 II，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液，隨后用空收集管離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，2分鐘，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器將離心管內(nèi)殘余的液體吸出，打開管蓋，將沉淀于超凈臺上晾5分鐘；或?qū)⒀b有沉淀的管子蓋緊蓋子后，放進一次性手套中，然后打開管蓋，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分鐘。最后洗提RNA，將制備管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，確保加入到制備管中央，隨后室溫靜置2分鐘，離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃。得到的RNA保存在超低溫冰箱。2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板,通過反轉(zhuǎn)錄酶催化,以dNTP為原料，合成DNA的過程，是DNA

生物合成的一種特殊方式。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成，合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程[

6、7]。

操作步驟包括收集管中配制模版RNA引物混合液，為6微升體系，包含模版RNA2微升，隨機引物1微升，無RNA酶雙蒸水3微升。70℃保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。離心數(shù)秒種使模版RNA引物的變性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，為10微升體系，包含上述模版RNA引物變性溶液6微升，隨機引物1微升，5倍濃度M-MLV 緩沖液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制劑0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，無RNA酶雙蒸水0.75微升。因為本實驗使用隨機引物，所以先于30℃恒溫水浴鍋保溫10分鐘，然后42℃保溫60分鐘。70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA做好標(biāo)記并保存于超低溫冰箱。2.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，它的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是利用DNA在體外95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制以得到多量脫氧核糖核酸[

9、10]。

本實驗第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用兩對引物分別擴增cDNA為DNA,目的是判斷哪一對引物擴增效果好，選擇其進行DNA擴增。準(zhǔn)備步驟包括制作雙蒸水，首先取蒸餾水200 微升，于超凈臺點燃酒精燈，安裝設(shè)備對蒸餾水再次蒸餾，PE管分裝后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭雙手，禁用雙手觸碰PE管口。RNA引物獲取，是將目的基因送至博士生物公司，由其進行引物的設(shè)計與合成；合成的引物經(jīng)過真空冷凍干燥，呈薄膜狀附在離心管中，盛有引物的離心管經(jīng)過離心后開啟，隨后加入規(guī)定量的雙蒸水合上管蓋充分振蕩使其溶解，備用。

操作步驟包括準(zhǔn)備四個PE管，并分別標(biāo)記為1-

1、1-

2、2-

1、2-2，將兩對引物分別加入兩個模版中，配制25微升體系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，雙蒸水11微升。將所有PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留混合液，隨后擺到雙面板上；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，打開電源開關(guān)，設(shè)置運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，4℃、保存時長，循環(huán)30次。

2.2 回收目的基因

2.2.1 核酸電泳

核酸電泳，其中利用了瓊脂糖凝膠，瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度[11]。將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當(dāng)時間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA[12]，一般來說，需要分離的目的基因片段越大，瓊脂糖濃度越小，凝膠密度越小，反之亦然。樣品加入量加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散。每孔點樣的體積一般少于25微升，吸取每一個樣品時，操作需謹(jǐn)慎，沒有顏色的樣品需要加入填充劑。另外，電泳系統(tǒng)須加入適宜DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進行判定，過大或過小的標(biāo)準(zhǔn)參照物姐不利于判定結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳準(zhǔn)備步驟包括核酸用瓊脂糖凝膠制作，配制1%的瓊脂糖凝膠，首先稱取1.000g瓊脂糖加入錐形瓶中，倒入100毫升電泳緩沖液TAE(50倍濃度TAE20毫升加1升水，混勻)，搖晃混勻后用封口膜封住瓶口后在微波爐內(nèi)加熱兩三分鐘，在水龍頭上沖涼冷卻至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此過程中注意自身防護。同時用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子，將配好的瓊脂糖凝膠液體倒入電泳槽，凝固約20分鐘。溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊，倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。

將完全凝固的瓊脂糖凝膠放置在加有緩沖液的電泳槽，緩沖液一定要沒過凝膠，由負(fù)極到正極電泳；瓊脂糖加樣時用移液搶將樣品加至點樣孔，動作穩(wěn)重注意不要戳破凝膠導(dǎo)致濾液，點樣是每孔加50微升樣品混合液，標(biāo)準(zhǔn)參照物加10微升；接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120A，電壓為120V，開始電泳；約20分鐘后樣品跑到五分之四凝膠寬度，取出電泳膠，觀察結(jié)果，以確定擴增目的基因引物為第一對或第二對(圖1)。

圖1 引物選擇PCR結(jié)果

Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 膠回收

cDNA擴增引物選擇結(jié)果顯示引物2的擴增效果較引物1好，因此選擇引物2進行目的基因擴增。加入第二對引物進行第二次的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA并回收產(chǎn)物，擴增使用高保真的連接酶。配制50微升體系，每管加入緩沖液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，雙蒸水24.3微升，隨后將PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，10℃、保存時長，循環(huán)40次。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，配膠過程同上，點樣時，每孔加50微升樣品混合液和5微升Loading，然后接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120Ma，電壓為120V，開始電泳。約20分鐘跑膠完成，觀察結(jié)果（圖2）。為對瓊脂糖凝膠電泳的某一核酸條帶做進一步分析，可對DNA進行膠回收

[

13、14]。

圖2 cDNA擴增結(jié)果

Figure 2 cDNA amplification results 本實驗使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對目的片段切膠回收。準(zhǔn)備步驟包括緩沖液 W2濃縮液中加入一定體積的無水乙醇，原因是此為第一次使用凝膠回收試劑盒。準(zhǔn)備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。準(zhǔn)備75℃水浴。試用前，檢查緩沖液 DE-B是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)應(yīng)于70℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括戴上防護帽在紫外燈下切下含有目的基因的DNA的瓊脂凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計算凝膠重量，用加入凝膠后稱量重量減去提前記錄的1.5毫升離心管重量，該重量作為一個凝膠體積。加入3個凝膠體積的緩沖液 DE-A，混合均勻后于75℃加熱，每而兩三分鐘間斷混合，直至凝膠完全融化。加0.5個緩沖液 DE-A體積的緩沖液 DE-B，混合均勻。吸取上一步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管，制備管置于2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加500毫升 緩沖液 W1，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加700毫升 緩沖液 W2，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。以同樣的方法加700毫升緩沖液 W2洗滌一次，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。將制備管置于潔凈的1.5毫升離心管中，在制備膜中央加30微升 Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，洗脫DNA。得到的DNA保存至超低溫冰箱。2.3 DNA分子體外連接

本實驗采用卡那霉素抗性T載體連接，此步驟即重組DNA分子，為目的基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞并復(fù)制的必要條件。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步:首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物;然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h過夜，這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

T載體連接操作時，首先于小PCR管中配制50微升體系，包括Solution I 5微升，回收產(chǎn)物4.5微升，T載體0.5微升。隨后混勻并于16℃連接過夜，連接時間至少8小時。2.4 轉(zhuǎn)化

外源 DNA 與載體分子的連接即為 DNA 重組技術(shù)，這樣重新組合的 DNA 分子叫做重組子。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過抗生素篩選法篩選出重組子，并可通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切，電泳，根據(jù)DNA Maker標(biāo)準(zhǔn)判斷陽性重組子中是否含有目的基因。感受態(tài)細(xì)胞制作原理為細(xì)菌在0°C氯化鈣低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)[15]。轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，即原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法[16]?；蚩寺≈械霓D(zhuǎn)化過程原理為質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長，從而鑒別選擇出轉(zhuǎn)化子。

準(zhǔn)備步驟包括配制LB培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、含抗生素LB培養(yǎng)基。首先，每升LB培養(yǎng)基，需在超純水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，溶解混勻；LB固體培養(yǎng)基是在每升LB培養(yǎng)基中加入15克瓊脂糖，混勻加熱溶解；制作含氨芐霉素培養(yǎng)基，稱量固體LB微波爐加熱3分鐘，沖冷水至不燙手，按1：1000比例加入氨芐霉素，倒薄薄的一層于培養(yǎng)皿中，待其凝固，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，倒置并標(biāo)記。

操作步驟包括準(zhǔn)備冰盒，打開42℃水恒溫浴鍋，將無抗LB提前放入37℃預(yù)熱；從超低溫冰箱取出E.coli DH5a 感受態(tài)菌株，將商品化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞快速且溫柔取于冰中，待其于冰中融化；在超凈工作臺作業(yè)，吸取10微升載體連接產(chǎn)物，緩慢加入感受

態(tài)中，反復(fù)抽吸三次混勻，動作需輕微，防止產(chǎn)生氣泡，放入冰盒30分鐘；將樣品放入42℃中熱激90秒，此為轉(zhuǎn)化必須環(huán)節(jié)；冰浴2分鐘，使其停止轉(zhuǎn)化過程；將預(yù)熱的無抗LB8微升加入樣品中，放入搖床45分鐘至60分鐘，復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞；將涂菌棒用酒精燈滅菌，從冰箱取出培養(yǎng)基放入37℃溫箱預(yù)熱；將搖好后的樣品4000g離心5分鐘，棄去上清600微升，余200微升，目的是使得細(xì)菌濃度升高，將剩余200微升樣品混勻，加到培養(yǎng)板上，用滅菌放涼的涂菌棒涂勻；涂菌后的培養(yǎng)基保存于37℃恒溫箱過夜。

培養(yǎng)大腸桿菌，在培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過夜，長出的菌落呈乳白色大圓點狀菌，表面和背面顏色一致，菌落邊緣整齊均勻，表面光滑濕潤,分散分布于整個培養(yǎng)皿（圖3）。隨后挑菌、搖菌、獲得菌液，用于篩選、抽提鑒定質(zhì)粒。挑菌時在細(xì)菌間超凈工作臺作業(yè)，取10只試管標(biāo)號，依次擺到試管架上，灼燒試管蓋和鑷子，用鑷子拔下試管蓋后，在此灼燒試管口和試管蓋，倒入約三分之一的氨芐抗性LB，用鑷子夾槍頭挑去細(xì)菌，連同槍頭扔進試管，灼燒管口和試管口，在火焰中蓋上試管蓋。搖菌是在37℃搖床，過夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。

圖3 轉(zhuǎn)化后大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果

Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒

質(zhì)粒是在細(xì)菌細(xì)胞中染色體之外能夠自主復(fù)制的共價閉合環(huán)狀雙螺旋的分子或遺傳因子。質(zhì)粒抽提原理即去除 RNA，且將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒[

17、18]。

本實驗采用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒。

準(zhǔn)備步驟包括RNA酶 A全部加入緩沖液 S1中并4℃貯存。準(zhǔn)備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。緩沖液 W2濃縮液中加入指定體積的無水乙醇，原因是第一次使用試劑盒。試用前，檢查緩沖液 S2是否出現(xiàn)沉淀，如有沉淀應(yīng)于37℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括取2毫升在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄盡上清。加250微升緩沖液 S1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需要均勻，不能夠有小的菌塊，確認(rèn)緩沖液W2中已加入無水乙醇。加250毫升，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的和中的中和，降低溶菌效率。避免劇烈搖晃，否則可能導(dǎo)致基因組DNA的污染，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。采用離心法純化質(zhì)粒，吸取上一步驟中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回離心管，加500微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回2毫升離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘。將制備管移入新的1.5毫升離心管中，在制備管中央加80 微升的Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，將Eluent或去離子水加熱至65℃能提高洗脫效率。隨后，質(zhì)粒測序鑒定目的基因是否插入。菌液PCR后使用隨機引物進行通測，引物合成及測序由北京華大生物公司完成（圖4、5）。

圖4 質(zhì)?；蚪M堿基序列

Figure 4 Plasmid genome base sequence

圖5 質(zhì)?；蚪M測序峰

Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 討論

本文構(gòu)建的目的基因LC3有關(guān)自噬活動，近年來，自噬在癌癥免疫因素感染炎癥和神經(jīng)退行性變等領(lǐng)域的研究不斷增加，準(zhǔn)確地檢測自噬基因?qū)τ谘芯孔允傻纳飳W(xué)功能至關(guān)重要，根據(jù)LC3的特點構(gòu)建重組質(zhì)粒，從而獲取大量LC3基因可作為自噬研究的組成環(huán)節(jié)。

本實驗采用反轉(zhuǎn)錄的方法獲取cDNA后，依據(jù)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳效果顯示第二對引物擴增的條帶比較清晰,由此選擇第二對引物進行擴增，得到相應(yīng)目的基因。采用T載體連接方法，將目的基因引入感受態(tài)大腸桿菌，進行基因克隆。轉(zhuǎn)化子擴增后，將轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒提取出，進行電泳、測序等進一步鑒定。轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)約600bp的明亮條帶,為目的基因條帶，說明目的基因成功導(dǎo)入細(xì)菌質(zhì)粒并復(fù)制，進一步的基因測序鑒定結(jié)果表明實驗完成了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建。最后使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，得到多量目的基因LC3。

整個過程的每個環(huán)節(jié)中皆包含影響實驗結(jié)果的因素，各個因素稍有變化既可能對實驗結(jié)果造成量或質(zhì)的影響，現(xiàn)將需要注意的幾個重要因素及其影響討論如下： 3.1試劑

試劑使用前應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀說明書。如用于提取RNA的Omega RNA提取試劑盒，其中的緩沖液 W2 濃縮液在提取開始或貯存在室溫條件前，必須用無水乙醇稀釋，如果使用了未經(jīng)處理濃縮液，則無法充分洗滌RNA，使得最后產(chǎn)物中存在大量雜質(zhì)。3.2 核酸酶

注意保證實驗環(huán)境中RNA酶量最小化，操作過程應(yīng)迅速且謹(jǐn)慎，始終戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶到試管或污染用具；避免在操作中說話聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、異丙醇等應(yīng)采用未開封的新瓶，使用專門配制的無RNA酶制備管、收集管。酶如果沒有被充分隔絕，將減少甚至提取不出RNA。3.3 核酸電泳緩沖液

瓊脂糖核酸電泳的緩沖系統(tǒng)在高離子強度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的選擇和濃度，而且不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。

DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響，凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，否則將導(dǎo)致實驗結(jié)果參照不準(zhǔn)。3.4 膠回收效率

將凝膠切成細(xì)小的碎塊可大大縮短凝膠融化時間，從而提高回收率；勿將含DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外燈對DNA造成的損傷；融化凝膠時應(yīng)當(dāng)完全，避免殘留降低回收率，以及阻塞制備管濾膜影響后續(xù)步驟也會降低回收效率。3.5 DNA酶切位點

基因克隆時選擇載體DNA酶切位點時應(yīng)注意兩個酶切位點的距離不應(yīng)過小，否則影響限制性內(nèi)切酶識別切點；目的基因片段內(nèi)部不應(yīng)含有所選的酶切位點；實驗后繼應(yīng)用的所有載體都盡可能含有所選的酶切位點，并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克?。20]；選擇較常用的酶切位點，兩個酶切點至少隔上3個堿基；使用酶切效率高，且雙酶切有共同緩沖液的酶。3.6 轉(zhuǎn)化效率

為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要考慮細(xì)胞生長狀態(tài)和密度，不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液；細(xì)胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制，DH5α菌株的OD600 為0.5 時,這時比較合適，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度方面應(yīng)注意用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA 的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低，1納克的超螺旋態(tài)DNA 即可使50微升的感受態(tài)細(xì)胞達到飽和，一般情況下,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的二十分之一[

18、19]。

試劑的質(zhì)量方面應(yīng)注意所用的試劑,如氯化鈣等均需是最高純度的，并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處；防止雜菌和雜DNA 的污染，整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管,Tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染[20], 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。3.7 試劑盒

本實驗使用了若干試劑盒，例如AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、美國Omega RNA提取試劑盒，使操作能夠擺脫繁重的試劑配制及優(yōu)化過程，試劑盒中配備有相應(yīng)使用說明書，按照說明書不需或只需少量的優(yōu)化即可得到滿意的結(jié)果，使用試劑盒時要根據(jù)自己的實驗需要選取專用提取試劑盒，如果不是專用試劑盒，提出的RNA不能確保其質(zhì)量以及完整性，會影響RT-PCR、基因克隆、抽提質(zhì)粒等后續(xù)實驗的結(jié)果。

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附錄1：離心力和離心轉(zhuǎn)速換算計算公式

RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相對離心力，單位為g N表示轉(zhuǎn)速，單位為rpm（轉(zhuǎn)/分）R表示離心半徑，單位為cm。

本實驗使用的離心機離心力和離心轉(zhuǎn)速換算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf

附錄2：試劑穩(wěn)定性

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

RNA酶 A，室溫可以貯藏6個月，長期貯存于-20℃；緩沖液 S1為細(xì)菌懸浮液，加入RNA酶 A后，混合均勻，4℃貯存；緩沖液 S2為細(xì)菌裂解液，室溫密閉貯存；緩沖液 S3為中和液，室溫密閉貯存；緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2為濃縮液或去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存。的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2 為濃縮液，又稱去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-A為凝膠融化劑，含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-B為結(jié)合液，室溫密閉貯存。

第四篇：企業(yè)重組研究

企業(yè)重組研究

摘要: 企業(yè)重組作為優(yōu)化資源配置的一種手段，一直是資本市場中令人關(guān)注的亙古不變的話題。尤其是20世紀(jì)90年代以來，隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，西方國家掀起了席卷全球的第五次兼并重組浪潮。中國企業(yè)兼并活動也隨之迅速發(fā)展，目前，兼并重組已成為我國企業(yè)發(fā)展壯大、參與國際競爭的重要戰(zhàn)略手段之一。隨著國有企業(yè)改革的進一步深化,企業(yè)的兼并、股權(quán)轉(zhuǎn)讓等活動日益增加,企業(yè)重組成為當(dāng)前經(jīng)濟活動中的熱門話題。中國經(jīng)濟結(jié)構(gòu)的調(diào)整,國民經(jīng)濟的發(fā)展及國有企業(yè)的改革都與企業(yè)重組息息相關(guān)。因此,研究中國企業(yè)重組問題有著極其重要的現(xiàn)實意義和理論意義。那么,什么是企業(yè)重組?企業(yè)重組能否提高企業(yè)的效益?企業(yè)重組對中國經(jīng)濟實踐有何啟示？本文圍繞著這些問題展開了研究。

關(guān)鍵詞:企業(yè)重組 問題研究 企業(yè)競爭

一．企業(yè)重組的現(xiàn)狀分析

（一）舍本求末——無視商業(yè)準(zhǔn)則

管理層為了實現(xiàn)向市場“圈錢”的目的，漠視基本的商業(yè)準(zhǔn)則，目光只關(guān)注短期對外公布會計報表的粉飾，缺乏對長期財務(wù)發(fā)展的考慮。他們舍棄追求實體經(jīng)濟的利潤增長，希望僅靠資本市場的操作，無節(jié)制地放大財務(wù)桿杠來做大做強，使企業(yè)忽視重組過程中的風(fēng)險控制，內(nèi)部控制缺失，企業(yè)重組后未圍繞核心能力和主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)來實施產(chǎn)業(yè)整合。上世紀(jì)在資本市場倒塌的德隆系、本世紀(jì)美國的“安然”，誘發(fā)對上市公司的內(nèi)部控制信心危機。

（二）缺乏長遠規(guī)劃

決策層對重組戰(zhàn)略目標(biāo)模糊，缺乏長遠規(guī)劃，使重組未能服務(wù)于企業(yè)戰(zhàn)略規(guī)劃。由于我國企業(yè)一般在面臨生存危機或是為了進行資本運作時才進行重組，使企業(yè)重組多具有緊迫性、被動性，重組前缺乏足夠的評估和準(zhǔn)備，這樣的重組難免步履艱難。那些ST上市公司為了逃避退市命運，慌忙割肉重組，如2008年賣殼失敗的ST得亨，2009年4月再次啟動資產(chǎn)重組，但終以“流產(chǎn)”告終。

（三）企業(yè)重組后內(nèi)部控制不力

企業(yè)重組后由于內(nèi)部管理接棒乏力，內(nèi)部控制處于弱勢。重組后不能盡快地完成公司治理結(jié)構(gòu)調(diào)整，整合資源，重組過程中內(nèi)部控制執(zhí)行力乏力。企業(yè)在資產(chǎn)重組后，陷入被重組企業(yè)的管理泥潭中，導(dǎo)致企業(yè)內(nèi)部出現(xiàn)矛盾與沖突，抵消乃至失去聯(lián)合重組帶來的種種優(yōu)勢，出現(xiàn)1十1<2的不正常現(xiàn)象。TCL并購湯姆遜后，由于執(zhí)行力不足，TCL的經(jīng)營理念無法在TTE的歐洲平臺上施展，TCL沒能在短時間內(nèi)實現(xiàn)兩企業(yè)的技術(shù)整合和管理整合，致使TCL為這次并購付出了巨額成本。

（四）目標(biāo)定位脫離實際

中國許多民營企業(yè)將資產(chǎn)重組等同于規(guī)模擴張，“盲目求太”，重組前后缺乏對市場和自身財務(wù)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、全面的收集和分析，重組目標(biāo)一開始脫離現(xiàn)實基礎(chǔ)，背離了企業(yè)正常成長的邏輯。1996年上海輪胎的銷售收入只有40個億，1997年在輪胎市場蕭條的背景下竟然希望通過資產(chǎn)重組在2000年實現(xiàn)產(chǎn)值100億元的戰(zhàn)略目標(biāo)。結(jié)果一系列并購，全部以巨大的虧損而告終。

（五）缺乏有效溝通

由于缺乏保證信息有效溝通的內(nèi)部控制機制，致使企業(yè)內(nèi)部對重組目標(biāo)不明確，執(zhí)行乏力，反映遲緩，重組沒能得到相關(guān)群體的充分配合。當(dāng)企業(yè)面臨公眾信用危機時，企業(yè)缺少危機響應(yīng)和處理的機制，導(dǎo)致企業(yè)內(nèi)外交困，自亂陣腳。

二、企業(yè)重組的方式

我國國有企業(yè)企業(yè)重組主體主要由兩個,一個是政府,另一個是企業(yè)。根據(jù)主體的作用不同,可以將企業(yè)重組分為政府主導(dǎo)的企業(yè)重組和企業(yè)主導(dǎo)的企業(yè)重組。

（一）政府主導(dǎo)的企業(yè)重組,即行政劃撥。

行政劃撥就是靠政府的行政手段來實現(xiàn)企業(yè)重組。行政劃撥是一種非常重要的方式。從理論上講,政府以行政手段對國有企業(yè)進行重組是力所應(yīng)當(dāng)?shù)?因為國有經(jīng)濟屬于國家,所有者是一元化的,因而可以進行行政劃撥。即使是成熟的市場經(jīng)濟國家,也不乏政府對國有企業(yè)進行行政性重組的事例。如歐洲客車公司,它是通過英、法兩國政府以行政手段,將國有的AerosPatn公司和Bar公司合并為空客公司,從而締造一個可以同波音公司競爭的大型企業(yè)。由于市場經(jīng)濟中,重組往往是市場優(yōu)勝劣汰力量的結(jié)果,但自發(fā)重組可能是一個相當(dāng)長的緩慢過程,對于在國際競爭中處于劣勢的國家來說,漫長的自發(fā)重組無異于投降認(rèn)輸。

中國的問題是,政府部門進行的重組方案,有時不是從企業(yè)效益出發(fā),而是從其他目標(biāo)出發(fā)。例如,政府可能出于社會穩(wěn)定的目標(biāo),將高負(fù)債的虧損企業(yè)的包袱甩給好企業(yè),造成贏利企業(yè)也變?yōu)樘潛p企業(yè)。另一個問題是如何處理

重組企業(yè)各自利益問題。十幾年來,國有企業(yè)改革的基本軌跡是允許剩余控制權(quán)和剩余索取權(quán)為各部門及企業(yè)分享,這個措施一方面調(diào)動了企業(yè)的積極性,另一方面也形成了各自的利益格局。如果行政性企業(yè)重組觸動到這個利益格局,就會遇到強大的阻力。這樣,即使硬性的將很多企業(yè)組合在一起,形成一個足夠大的公司,企業(yè)可能已經(jīng)失去活性,企業(yè)重組也就失去了意義。

（二）企業(yè)主導(dǎo)的企業(yè)重組,即市場交易。

市場交易就是通過市場的方式進行企業(yè)重組。本文根據(jù)我國上市公司企業(yè)重組的實踐,將企業(yè)重組根據(jù)重組目的不同分為四大方式,即擴張式企業(yè)重組、收縮式企業(yè)重組、控制權(quán)轉(zhuǎn)移式企業(yè)重組和內(nèi)部重整式企業(yè)重組。

1.擴張式企業(yè)重組

擴張式企業(yè)重組通常指擴大套司經(jīng)營規(guī)模和資產(chǎn)規(guī)模的一大類重組行為。包括:

購買資產(chǎn)。即購買房地產(chǎn)、債權(quán)、業(yè)務(wù)部門、生產(chǎn)線、商標(biāo)等有形或無形的資產(chǎn)。收購資產(chǎn)的特點在于收購方不必承擔(dān)與該部分資產(chǎn)有關(guān)聯(lián)的債務(wù)和義務(wù)。以多角化發(fā)展為目標(biāo)的擴張通常不采取收購資產(chǎn)而大都采取收購公司的方式來進行,因為缺乏有效組織的資產(chǎn)通常并不能為公司帶來新的核心能力。收購公司。收購公司通常指獲取目標(biāo)公司全部股權(quán),使其成為全資子公司或者獲取大部分股權(quán)處于絕對控股或相對控股地位的重組行為。購買公司不僅獲得公司的產(chǎn)權(quán)與相應(yīng)的法人財產(chǎn),同時也是所有因契約而產(chǎn)生的權(quán)利和義務(wù)的轉(zhuǎn)讓。因此收購公司可以獲得目標(biāo)公司擁有的某些專有權(quán)利如專營權(quán)、經(jīng)營特許權(quán)等,更能快速地獲得由公司的特有組織資本而產(chǎn)生的核心能力。收購股份。一般指不獲取目標(biāo)公司控制權(quán)的股

權(quán)收購行為,只處于參股地位。收購股份通常是試探性的多角化經(jīng)營的開始和策略性的投資?；蚴菫榱藦娀c上、下游企業(yè)之間的協(xié)作關(guān)聯(lián),如參股原材料供應(yīng)商以求保證原材料供應(yīng)的及時和價格優(yōu)惠,參股經(jīng)銷商以求產(chǎn)品銷售的順暢、貨款回收的及時。合資或聯(lián)營組建子公司。公司在考慮如何將必要的資源與能力組織在一起從而能在其選擇的產(chǎn)品市場取得競爭優(yōu)勢的時候,通常有三種選擇,即內(nèi)部開發(fā)、收購以及合資。對于那些缺少某些特定能力或者資源的公司來說,合資或聯(lián)營可以作為合作戰(zhàn)略的最基本手段,它可以將公司與其他具有互補技能和資源的合作伙伴聯(lián)系起來,獲得共同的競爭優(yōu)勢。公司的合并。這是指兩家以上的公司結(jié)合成一家公司,原有會司的資產(chǎn)、負(fù)債、權(quán)利義務(wù)由新設(shè)或存續(xù)的公司承擔(dān)。我國《公司法》界定了兩種形式的合并:吸收合并和新設(shè)合并。從本質(zhì)上講這兩種形式的合并并沒有太大的不同,唯一的區(qū)別在于公司名稱變與不變。公司合并的目的是實現(xiàn)戰(zhàn)略伙伴之間的一體化,進行資源、技能的互補,從而形成更強、范圍更廣的公司核心能力,提高市場競爭力。同時,公司合并還可以減少同業(yè)競爭,擴大市場份額。

2.收縮式企業(yè)重組

收縮式企業(yè)重組活動,包括:(1)部分經(jīng)營性或非經(jīng)營性資產(chǎn)剝離,其中非經(jīng)營性資產(chǎn)剝離同中國過去“大而全”、“小而全”的企業(yè)組織有關(guān);(2)子公司股權(quán)剝離;(3)公司股份回購縮股。收縮式重組僅僅限于單純的資產(chǎn)或股權(quán)剝離與回購,資產(chǎn)置換不考慮在內(nèi),控制權(quán)轉(zhuǎn)移類型的公司剝離資產(chǎn)的行為同樣視為該種重組的完整部分,不計入收縮式重組。資產(chǎn)出售或剝離,公司將其擁有的某些子公司、部門、產(chǎn)品生產(chǎn)線、固定資產(chǎn)等出售給其他的經(jīng)濟主體。由于出售這些資產(chǎn)可以獲得現(xiàn)金回報,因此從某種意義上來講,資產(chǎn)剝離并未減小資產(chǎn)的規(guī)模,而只是公司資產(chǎn)形式的轉(zhuǎn)化,即從實物資產(chǎn)轉(zhuǎn)化為貨幣資產(chǎn)。

3.控制權(quán)轉(zhuǎn)移式企業(yè)重組

控制權(quán)轉(zhuǎn)移式企業(yè)重組,是指公司控股權(quán)的轉(zhuǎn)移,即原第一大股東放棄控股權(quán),新的企業(yè)主體以凈資產(chǎn)溢價方式有償取得目標(biāo)公司控制權(quán)或在政府干預(yù)下無償獲得國家股從而取得控股股東地位,包括原非控股股東轉(zhuǎn)為控股股東。完整的控制權(quán)轉(zhuǎn)移是由兩個交易過程構(gòu)成的:一是收購上市公司控股權(quán),二是上市公司反向收購新的控股股東的資產(chǎn)。中國上市公司控制權(quán)轉(zhuǎn)移活動較為復(fù)雜。從股權(quán)轉(zhuǎn)移是否有明確的支付價格分類,有控股股東所持股權(quán)無償劃撥和股權(quán)收購兩種類型;從收購主體分類,有民營企業(yè)和國有或國有控股企業(yè)收購上市公司控股股權(quán);從收購方式分類,有國有股或法人股協(xié)議轉(zhuǎn)讓和二級市場收購。常見的公司控股權(quán)及控制權(quán)的轉(zhuǎn)移方式有以下幾種:

股權(quán)的協(xié)議轉(zhuǎn)讓。即股權(quán)的出讓與受讓雙方不通過交易所系統(tǒng)集合競價的方式進行買賣,而是通過面對面的談判方式,在交易所外進行交易,因而通常稱之為場外交易。這些交易往往出于一些特定的目的,如引入戰(zhàn)略合作者,被有較強實力的對手善意收購等。我國的資本市場,場外協(xié)議轉(zhuǎn)讓案例產(chǎn)生的主要原因在于證券市場中處于控股地位的大量非流通股的存在。

公司股權(quán)托管和公司托管。公司股東將其持有的股權(quán)以契約的形式,在一定條件和期限內(nèi)委托給其它法人或自然人,由其代為行使對公司的表決權(quán)。當(dāng)委托人為公司的控股股東時,公司股權(quán)托管就演化為公司的控制權(quán)托管,使受托人介入公司的管理和運作,成為整個公司的托管。

表決權(quán)信托與委托書收購。表決權(quán)信托就是許多分散股東集合在一起設(shè)定信托,將自己擁有的表決權(quán)集中于受托人。使受托人可以通過集中原本分散的股權(quán)來實現(xiàn)對公司的控制。委托書收購是一種中小股東影響和控制公司的方法。在股權(quán)

結(jié)構(gòu)相對分散的公司里,中小股東可以通過征集其它股東的委托書來召集臨時股東大會并達到改組公司董事會控制公司的目的。

股份回購。套司或是用現(xiàn)金或是以債權(quán)換股權(quán)或是優(yōu)先股換普通股的方式購回其流通在外的股票。這樣會導(dǎo)致公司股權(quán)結(jié)構(gòu)的變化,由于公司股本縮減,而控股大股東的股權(quán)沒有發(fā)生改變,因而原有大股東的控股地位得到強化。我國《公司法》對上市公司回購股份有著較為嚴(yán)格的限制,只有在注稍股本或與其他公司合并時方能購回發(fā)行在外的股票,并須及時變更登記和公告。

交叉控股。交叉控股是母子公司之間互相持有絕對控股權(quán)或相對拉股,使母子公司之間可以互相控制運作。交叉拉股產(chǎn)生的原因是母公司增資擴股時,子公司收購母公司新增發(fā)的股份。我國((公司法》規(guī)定,一般會司對外投資不得超過凈資產(chǎn)的50%,這在一定程度上限制了母子公司間的交叉控股,但亦可以通過多層的逐級控股方式迂回地達到交叉控股的目的。交叉控股的一大特點是企業(yè)產(chǎn)權(quán)模糊化,找不到最終控股大股東,公司的管理人員取代公司所有者成為公司的主宰,形成內(nèi)部人控制。

4.內(nèi)部重整式企業(yè)重組

內(nèi)部業(yè)務(wù)重整式企業(yè)重組是指重整公司主營業(yè)務(wù)。公司重整主營業(yè)務(wù),包括部分資產(chǎn)置入與置出和整體資產(chǎn)置入與置出。部分資產(chǎn)置入與置出即部分資產(chǎn)置換,方法是:交易雙方(通常是關(guān)聯(lián)方,即控股公司和重組目標(biāo)公司)將經(jīng)過評估的資產(chǎn)進行等值置換,控股公司置入的資產(chǎn)是優(yōu)質(zhì)資產(chǎn),被重組公司置出的則是劣質(zhì)資產(chǎn)。整體資產(chǎn)置入與置出即整體資產(chǎn)置換,通常發(fā)生在控制權(quán)轉(zhuǎn)移類型的公司重組中,或公司主營業(yè)務(wù)無以維系的公司中。

資產(chǎn)置換。這是指公司重組中為了使資產(chǎn)處于最佳配置狀態(tài),獲取最大收

益或出于其他目的而對其資產(chǎn)負(fù)債表的資產(chǎn)類進行交換。由于某種原因,公司一些非核心資產(chǎn),效率低下,降低了企業(yè)的整體盈利能力,而這些資產(chǎn)卻又是另一企業(yè)所急需的。雙方通過資產(chǎn)置換能夠獲得與自己核心能力相協(xié)調(diào)的、相匹配的資產(chǎn)。這一過程應(yīng)是一個互利的雙贏過程,而時下國內(nèi)證券市場上頻頻出現(xiàn)的所謂資產(chǎn)置換,往往是在政府行為的推動下,旨在買“殼”或借“殼”的一種關(guān)聯(lián)交易行為。在交易過程中,往往是不等價的。

三、企業(yè)重組的意義

經(jīng)過20多年的經(jīng)濟體制改革,我國國民經(jīng)濟的微觀基拙得到了很大的完善。但是,隨著改革的日益深入,新舊經(jīng)濟體制的沖突越來越尖銳,特別表現(xiàn)在國有企業(yè)與市場經(jīng)濟不適應(yīng),國有企業(yè)出現(xiàn)整體上效益下降,虧損增加現(xiàn)象。如何促進國有資產(chǎn)有效運營,改變國有企業(yè)這種越來越困難的局面,成為大家普遍關(guān)注的問題。目前,越來越多的人主張加速企業(yè)重組,從而重塑社會主義市場經(jīng)濟運行的微觀基礎(chǔ)。

(一)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整需要企業(yè)重組

當(dāng)前經(jīng)濟結(jié)構(gòu)的不合理主要表現(xiàn)在基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)、傳統(tǒng)加工業(yè)和新一代支柱產(chǎn)業(yè)“兩頭小,中間大”的不合理格局上:一是基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)的支撐力小。盡管近年來,我國對能源、原材料、運輸?shù)然A(chǔ)工業(yè)和基礎(chǔ)設(shè)施加大了投入力度,某些方面的矛盾有些緩解。但從目前情況看,基拙工業(yè)總體上仍不能滿足整個國民經(jīng)濟的需求。二是以輕紡為主體的傳統(tǒng)加工工業(yè)能力過大,素質(zhì)低。80年代以來,傳統(tǒng)加工工業(yè)生產(chǎn)能力迅猛擴大,但這種迅速增長是一種低水平的擴張,引起傳統(tǒng)加工工業(yè)在國內(nèi)市

場陷入嚴(yán)重飽和狀態(tài)。三是新一代支柱產(chǎn)業(yè)帶動力小。我國新一代支柱產(chǎn)業(yè)和先導(dǎo)產(chǎn)業(yè)還比較弱小,不能滿足日益增長的國內(nèi)需要和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級的要求。我國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)在工業(yè)總產(chǎn)值中所占比重也遠遠落后于發(fā)達國家的水平。由此可見,我國的經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整面臨著加強基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)、改造傳統(tǒng)加工業(yè)、振興新一代支柱產(chǎn)業(yè)的艱巨任務(wù)。調(diào)整經(jīng)濟結(jié)構(gòu),有兩種方法。一是增量調(diào)整為主的外延式擴張。增量投入一般見效較快,但是,增量投入有很大的局限性。一方面,增量投入往往通過向短線加大投資來調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的不合理,從而忽視長線生產(chǎn)力的培養(yǎng),這樣會帶來資源的極大浪費;另一方面,靠增量投入這種方式調(diào)節(jié)經(jīng)濟結(jié)構(gòu),國家必須有大量的投入。我國增量投入主要是財政和銀行,財政現(xiàn)在被巨大的財政赤字所困擾,銀行被龐大的不良債務(wù)所困擾,因而用增量投入解決結(jié)構(gòu)不合理是不可能的。二是存量調(diào)整為主的內(nèi)涵式發(fā)展,即企業(yè)重組。我國國有經(jīng)濟中現(xiàn)在僅有1/3的效益比較好,大量的國有資產(chǎn)被閑置或低效益使用。尤其是,這部分存量資產(chǎn)中有很大一部分是變現(xiàn)能力很強的資產(chǎn),也需要靠存量調(diào)整來解決。以存量調(diào)整為主,推動資產(chǎn)向優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)和企業(yè)轉(zhuǎn)移,不僅可以大大提高現(xiàn)有的資產(chǎn)利用率,而且也可以帶動增量投入結(jié)構(gòu)的優(yōu)化?？看媪空{(diào)整解決結(jié)構(gòu)調(diào)整問題,就是企業(yè)重組問題。因而,從經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整的角度看,企業(yè)重組是極其重要的。

(二)國民經(jīng)濟發(fā)展需要企業(yè)重組

企業(yè)重組是我國經(jīng)濟發(fā)展的一個新的推動力。改革開放以來,我國的經(jīng)濟發(fā)展經(jīng)歷了財政推動,銀行推動,到目前轉(zhuǎn)向以資本市場為主的企業(yè)重組推動,清華大學(xué)魏杰教授稱之為三級火箭推動。

從1978年到1986年,這段時間的改革與發(fā)展主要靠財政推動,財政是第一級火箭。這一期間,我國進行了價格改革。放開價格后,企業(yè)承受不了生產(chǎn)資料漲價,居民承受不了消費品漲價,結(jié)果都靠財政補貼。當(dāng)時企業(yè)改革先后進行了放權(quán)讓利和承包制,最后企業(yè)少繳的利稅部分都靠財政補貼。財政作為我國改革開放的第一級火箭推動器,起了很大的作用,但也造成巨額的財政赤字?！傲濉?、“七五”、“八五”期間財政赤字逐年增加。同時,財政用于經(jīng)濟建設(shè)的支出大幅下降。真正用于企業(yè)經(jīng)營性資產(chǎn)僅占支出10%左右,財政推動力作用的效果逐漸減弱。從1987年至1994年,銀行成為我國改革的第二級火箭。這段時間各種經(jīng)濟成分的發(fā)展多靠銀行。我國在1987年進行了“撥改貨”改革,銀行成了主要的資金投入者。我國的國有企業(yè)1987年負(fù)債率還不到20%,目前負(fù)債率平均在80%以上,國有企業(yè)的債務(wù)急劇增加。這段期間,中國的改革與發(fā)展主要靠銀行推動,但是,銀行也形成了巨大的不良債務(wù)。如果再靠銀行貨款推動經(jīng)濟發(fā)展,一旦出現(xiàn)支付危機,金融制度就要崩潰。因此,需要尋找推動經(jīng)濟發(fā)展的第三級火箭。第三級火箭,就是企業(yè)重組。在目前,我國國有資產(chǎn)中有1/3是閑置的,1/3是低效益使用的,因而,我國的國有資產(chǎn)很大一部分實際上沒有充分利用起來。如果通過企業(yè)重組,將這一部分資產(chǎn)充分利用起來,中國經(jīng)濟將進入一個新的發(fā)展時期。因此,企業(yè)重組是尋找一個新的經(jīng)濟發(fā)展動力的需要。

(三)國有企業(yè)改革需要企業(yè)重組

我國的國有企業(yè)改革如今已到了關(guān)鍵時刻。國有企業(yè)改革能否求得根本性的突破關(guān)系著我國未來經(jīng)濟的發(fā)展?fàn)顩r,是我國改革進程中極為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。企業(yè)重組對推動我國國有企業(yè)改革有極其重要的作用,主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

首先,企業(yè)重組可以提高我國企業(yè)的競爭力。我國國有企業(yè)數(shù)量很多,但主要以中小企業(yè)為主,有時比較分散,難以形成規(guī)模經(jīng)濟,因此很難參與國際競爭。通過

企業(yè)重組,可以將企業(yè)的優(yōu)勢集中起來,形成一定數(shù)量的企業(yè)集團,從而增強國有業(yè)在國際市場上的競爭能力。這里需要注意的是,雖然企業(yè)規(guī)模擴大可以提高競爭能力,但是追求盲目的規(guī)模擴張對企業(yè)發(fā)展也是無益的。并且,隨著企業(yè)規(guī)模的擴大,將會產(chǎn)生行業(yè)壟斷問題,這也不利于我國經(jīng)濟的發(fā)展。對于這些問題,本文在后面將進行較詳細(xì)的闡述。

其次,企業(yè)重組可以提高企業(yè)的融資能力。國有企業(yè)改革和發(fā)展都需要尋找新的資金來源。國有企業(yè)不能再像傳統(tǒng)那樣僅靠財政撥款和銀行貨款來發(fā)展普遍關(guān)注的問題。目前,越來越多的人主張加速企業(yè)重組,從而重塑社會主義市場經(jīng)濟運行的微觀基礎(chǔ)。

綜上所述，企業(yè)重組作為優(yōu)化資源配置的一種手段，一直是資本市場中令人關(guān)注的亙古不變的話題。尤其是20世紀(jì)90年代以來，隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，西方國家掀起了席卷全球的第五次兼并重組浪潮。中國企業(yè)兼并活動也隨之迅速發(fā)展，目前，兼并重組已成為我國企業(yè)發(fā)展壯大、參與國際競爭的重要戰(zhàn)略手段之一。因而，本文的研究對于我國今后國有企業(yè)重組的理論與實踐具有非常重要的意義。黨的十六大以來，尤其是十六屆四中全會以后，明確提出了構(gòu)建社會主義和諧社會的歷史任務(wù)。“民主法治、公平正義、誠信友愛、充滿活力、安定有序、人與自然和諧相處”是這一社會的總體特征。當(dāng)前我國改革與發(fā)展進入關(guān)鍵時期，經(jīng)濟體制深刻變革，社會結(jié)構(gòu)深刻變動，利益格局深刻調(diào)整，思想觀念深刻變化，這一空前的社會變革既給我國發(fā)展進步帶來巨大活力，也使統(tǒng)籌兼顧各方面利益的任務(wù)變得更加艱巨而繁重。在此背景下進行國有企業(yè)重組研究，必然具有其特殊意義。

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第五篇：企業(yè)債務(wù)重組研究

企業(yè)債務(wù)重組研究

債務(wù)重組準(zhǔn)則的規(guī)定既需要符合國家政策的需要，也需要符合會計信息質(zhì)量的要求。債務(wù)重組中，債權(quán)人對其債權(quán)作出讓步，此時產(chǎn)生了對償債物資價值、債務(wù)重組收入和損失、資產(chǎn)處置收益或損失等的核算與計量問題。我國債務(wù)重組會計準(zhǔn)則規(guī)定，債權(quán)人將債務(wù)人用于償還債務(wù)的固定資產(chǎn)設(shè)備按公允價值計量。然而，債務(wù)人用于抵債的固定資產(chǎn)大多是已經(jīng)使用過的舊固定資產(chǎn)，其入賬價值需要遵循謹(jǐn)慎性原則，以成本與市價孰低計價。債務(wù)重組過程中產(chǎn)生收益或損失全部計入當(dāng)期損益，造成了債務(wù)人當(dāng)期利潤的虛增，顯然是不合理的。

一 債務(wù)重組的含義和產(chǎn)生

（一）債務(wù)重組的含義

（二）債務(wù)重組的產(chǎn)生

（三）債務(wù)重組產(chǎn)生的意義

1.債務(wù)重組產(chǎn)生對債權(quán)人的意義

2.債務(wù)重組產(chǎn)生對債務(wù)人的意義

二 債務(wù)重組的會計處理

（一）債權(quán)人的會計處理

1.以債務(wù)轉(zhuǎn)為資本清償債務(wù)的會計處理

2.以修改其他債務(wù)條件清償債務(wù)的會計處理

3.以組合方式清償債務(wù)的會計處理

（二）債務(wù)人的會計處理

1.以債務(wù)轉(zhuǎn)為資本清償債務(wù)的會計處理

2.以修改其他債務(wù)條件清償債務(wù)的會計處理

3.以組合方式清償債務(wù)的會計處理

三 新舊債務(wù)重組準(zhǔn)則的比較及新債務(wù)重組準(zhǔn)則的實施

（一）新舊債務(wù)重組準(zhǔn)則的比較

1.定義及重組方式比較

2.重組方式比較

（二）會計處理比較

1.計稅基礎(chǔ)不同

2.損益處理不同

（三）新債務(wù)重組實施的原因

1.公允價值計量方面

2.會計處理方法方面

（四）新債務(wù)重組實施的利弊

1.公允價值難以取得

2.不利于減少操縱利潤現(xiàn)象

3.對債務(wù)雙方財務(wù)有影響

四 債務(wù)重組帶來的會計問題

1.相關(guān)稅費處理在債務(wù)重組準(zhǔn)則中沒有明確規(guī)定

2.債務(wù)重組損益全部計入當(dāng)期損益不符合權(quán)責(zé)發(fā)生制原則和配比原則

3.債務(wù)重組損失的反映違背了一致性原則

4.公允價值的運用缺乏市場基礎(chǔ)

5.抵債固定資產(chǎn)入賬違背謹(jǐn)慎性原則

五 對債務(wù)重組帶來會計問題的應(yīng)對措施

（一）對重組產(chǎn)生的相關(guān)稅費處理問題的措施

（二）債務(wù)重組損益是否一次計入當(dāng)期損益的處理措施

（三）對重組損益反映在一個會計賬戶的處理措施

（四）公允價值合理運用的應(yīng)對措施

（五）固定資產(chǎn)入賬價值缺乏謹(jǐn)慎的處理措施

參考文獻

［１］劉雪雁．論新舊債務(wù)重組準(zhǔn)則的差異［Ｊ］宿州教育學(xué)院報．２００９．０２［２］尹鋒．淺析新準(zhǔn)則下的財務(wù)重組［Ｊ］宿州教育學(xué)院報．２００９．０４

［３］周詠梅．債務(wù)重組會計準(zhǔn)則存在的問題及改進建議［Ｊ］．中國新科技新產(chǎn)品．２０００９．７：１８７－１８７