第一篇：血液總RNA抽提

血液總RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液體中RNA的抽提）中，劇烈震蕩，靜置。2.加入200ul 三氯甲烷，劇烈震蕩，靜置10min。3.4度，12000g 離心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(與所吸出的上清比列為1:1)異丙醇，并加入1ul的糖原，輕輕上下顛倒混勻，-20度冰箱沉淀過夜。5.4度，12000g 離心15min。留沉淀（RNA），將上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下顛倒，洗滌RNA沉淀。6.4度7500g離心10min。去上清，將沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第二篇：RNA抽提知識

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品

如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí)，抽提RNA的實(shí)驗(yàn)就會(huì)碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí)，只有對實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時(shí)提醒的是：沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真的了。

3：實(shí)驗(yàn)樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個(gè)問題非常重要，應(yīng)該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個(gè)簡單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個(gè)細(xì)胞；我的建議是，樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會(huì)比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪?？紤]后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實(shí)驗(yàn)樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時(shí)，還得考慮大量的樣品可能也會(huì)帶來大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時(shí)，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴(yán)重，含量大打折扣，所以取樣時(shí)應(yīng)該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細(xì)胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達(dá)到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅(jiān)硬，普通的勻漿器根本無法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細(xì)菌 Trizol雖然對細(xì)胞的裂解效果出眾，但是對細(xì)菌堅(jiān)韌的細(xì)胞壁還是無可奈何，這時(shí)我們可以利用超聲來輔助破壁。將細(xì)菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補(bǔ)至1ml。3)酵母 酵母細(xì)胞跟細(xì)菌一樣，還是因?yàn)榧?xì)胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細(xì)胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點(diǎn)就不用擔(dān)心這步有RNA降解的問題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞?，選用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對待的，但對于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實(shí)驗(yàn)的操作難點(diǎn)，一定要謹(jǐn)慎，萬不可混入有機(jī)相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實(shí)際操作中，有的雜質(zhì)也會(huì)與RNA一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實(shí)驗(yàn)樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過，導(dǎo)致會(huì)殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們往往是非常強(qiáng)的酶抑制劑，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來且影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個(gè)方法優(yōu)點(diǎn)是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒有遇到這種方法處理不了的），缺點(diǎn)是成本比較高。對與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會(huì)很低，而且基本看不見沉淀物，這也會(huì)給后續(xù)的操作帶來很大的麻煩，進(jìn)一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來，又不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不要迷信試劑說明書里的標(biāo)準(zhǔn)方法；有時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題在標(biāo)準(zhǔn)方法中是找不到答案的，要具體問題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點(diǎn)：首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)RNA沉淀比較大時(shí) ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時(shí)是能看見管底的白色沉淀，但還是有時(shí)候是看不見的，即使是加過Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒看見不等于沒有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時(shí)仔細(xì)觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒問題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應(yīng)盡快保存在-70℃，避免反復(fù)凍融，同時(shí)注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應(yīng)該是酶殘留導(dǎo)致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，不可全信。目前實(shí)驗(yàn)室用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時(shí)電泳還可以用于估計(jì)核酸的濃度，其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。NANO-Drop檢測的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準(zhǔn)確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時(shí)進(jìn)行NANO-Drop檢測和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測時(shí)提示的含量有可見的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）

第三篇：RNA的抽提與鑒定

RNA的抽提與鑒定

背景

核糖核酸(RiboNucleic Acid，簡稱RNA)是由至少幾十個(gè)核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。

遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程(某些致癌病毒)是對中心法則的補(bǔ)充。

三種常見的RNA 1.mRNA 信使RNA 功能：蛋白質(zhì)合成的直接模板 2.tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 功能：氨基酸的運(yùn)載體

3.rRNA 核糖體RNA 功能：核糖體的組成成分，蛋白質(zhì)的合成場所

其他小分子RNA 1.hnRNA 核內(nèi)不均一RNA 成熟mRNA的前提 2.snRNA 核內(nèi)小RNA 參與hnRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn) 3.snoRNA 核仁小RNA rRNA的加工與修飾

4.scRNA/7SL-RNA 胞質(zhì)小RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)置為定位合成信號識別體組成成分 5.siRNA 小的干擾RNA siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三類，這三種類型的RNA都存在于細(xì)胞質(zhì)中，所以從不同組織中提取的總RNA的本質(zhì)就是細(xì)胞的裂解，RNA的釋放，通過不同的方式去除蛋白質(zhì)，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度的RNA產(chǎn)品工藝。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。2臨床診斷中的應(yīng)用：病毒檢測等

RNA提取的方法及步驟

1提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來。（該方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。）

2在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相，而達(dá)到分離RNA的目的。

根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下兩種制備方法： 1胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 2LiCl/尿素法 以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。

Trizol（異硫氰酸胍-苯酚法）

1由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的單相的快速抽提試劑；

2可在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性；

3在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA； Trizol可以從最少100個(gè)細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。如果細(xì)胞量過少或組織來源特異，可以采用相應(yīng)試劑盒提取RNA。

Trizol法的原理

1異硫氰酸，β-巰基乙醇，SDS裂解細(xì)胞

2酸性條件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，離心，蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA存在于水相

3異丙醇沉淀水相中的RNA

Trizol法提取RNA操作步驟

1.剪碎的鼠肝中加入Trizol試劑，進(jìn)行機(jī)械勻漿，取1ml Trizol勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5分鐘，以充分裂解細(xì)胞。目的：變性劑充分作用裂解細(xì)胞，釋放核酸。2.每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。

3.4℃ 12,000rpm離心15min；

4.吸取上層水相，至另一離心管中；注：不要吸取中間界面。目的：分離RNA、DNA、蛋白質(zhì)等。

5.加入0.5ml 異丙醇混勻，室溫放置5-10min；

6.4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底；目的：沉淀RNA。異丙醇會(huì)奪取大量RNA分子間的水分子，因此RNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。（此時(shí)可放-70℃保存）目的：洗滌RNA，去除殘余的鹽類等雜質(zhì)。8.4℃10000rpm離心5min，盡量棄上清。

9.短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。

10.用200ul(體積可根據(jù)RNA的沉淀量具體調(diào)整)DEPC處理的H2O溶解RNA樣品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。

簡易TBE電泳觀察RNA的完整度 1制膠：瓊脂糖凝膠粉（0.7%），消毒TBE緩沖液，Goldview顯色劑

2上樣：10ul樣品（含上樣緩沖液）混勻后，加入凝膠孔中；上樣緩沖液（loading Buffer): 溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、蔗糖，甘油 3電泳：電泳110V，15min。4紫外燈下觀察

RNA 質(zhì)量及純度的分析

方法

一、檢測RNA溶液的吸光度 260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)的水平；

純的RNA，230：260：280＝1：2：1；

一般OD260/OD280= 1.8~2時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的； 當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯； 當(dāng)R>2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了； RNA濃度=OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。

方法

二、RNA的電泳圖譜

檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量好。

方法

三、保溫試驗(yàn)

RNA溶液在70℃的恒溫水浴中保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。比較兩者的電泳條帶，說明RNase的污染情況。

如何盡量避免RNA的降解？

1及時(shí)處理樣本，或置液氮中保存

2試驗(yàn)器皿及配置試劑用水用0.1%DEPC處理且高壓消毒 3盡可能早的去除組織與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) 4聯(lián)合使用RNase抑制劑

5操作過程中，戴手套口罩，避免空氣流通 6進(jìn)行完整性的檢測

第四篇：invitrogen trizol rna抽提說明書

RNA抽提全過程(TRIZOL)

一，準(zhǔn)備工作 1，實(shí)驗(yàn)器具與材料：

（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul

（3）吸頭臺：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一個(gè)（配75％乙醇用）

2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備

（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺?；蛑苯淤徺I經(jīng)DEPC處理的槍頭和EP管,每盒大約30元,基本上試劑公司都可以購買。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸過夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時(shí)左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金屬制品：（鑷子等）

先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，試劑配制和準(zhǔn)備：

（1）DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓。

（2）75％乙醇（要在抽提時(shí)現(xiàn)配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆?。?）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提時(shí)注意事項(xiàng)：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。

三，抽提步驟 1． 勻漿化作用

取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。2． 分離階段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3． RNA的沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。4． RNA的洗脫 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時(shí)RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會(huì)極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

TRIzol法抽提總RNA

組織100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，勻漿（研磨時(shí)倒入液氮，研磨完后從研缽轉(zhuǎn)入EP管中，）（組織勻漿量>100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）↓

顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）↓

顛倒混勻15S，室溫5分鐘 ↓

4℃，離心12000rmp，15分鐘 ↓

轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中間那層）↓

加等體積異丙醇（約400-500μl）↓

4℃，離心12000rmp，10分鐘 ↓

棄上清 ↓

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml ↓

4℃離心7500rmp，5分鐘 ↓

棄上清，超凈工作臺開風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此處可按照實(shí)際情況修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）↓

立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄

RNA純度檢測及定量

從36μl中取6μl，用無RNA酶的水稀釋100倍至600μl，用DU70型分光光度儀分別測定樣品在260nm、280nm波長的光密度值，計(jì)算出RNA的濃度（μg/ml）。

純RNA樣品的A260/A280比值為1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白質(zhì)污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA樣品的A260/A230比值應(yīng)大于2.0，若低于該標(biāo)準(zhǔn)，提示有變性緩沖液殘留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗滌，以除去殘留的變性緩沖液。

RNA電泳

用無Rnase水配TAE電泳液，稱1.0g新開封的瓊脂糖，加TAE電泳液至100ml，煮沸，加溴乙錠20μl，降至室溫后灌膠置DEPC水處理過的電泳槽中，凝固20min，加TAE 緩沖液浸沒膠塊。取15μl RNA加6×RNA專用上樣緩沖液3μl，混勻，用移液槍將樣品加入上樣孔內(nèi)，待溴酚藍(lán)遷移至理想位置后，終止電泳，紫外燈下觀察、拍照。

上傳RNA電泳條帶如下

最下面條帶代表5s 色淺代表RNA基本無降解

如出現(xiàn)拖把狀條帶 則為降解較嚴(yán)重情況

但有時(shí)這種情況也可以照樣RT－PCR

我們同學(xué)就有在低溫冰箱放了幾個(gè)月的組織照樣可以出結(jié)果的

第五篇：血液標(biāo)本抽提DNA

抗凝全血中提取DNA

準(zhǔn)備： 配制80%異丙醇和70%乙醇各1ml備用。選擇2ml的 離心管。血液的體積為2ml。先向2ml的離心管中加入1ml的血液。后加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。再加入1ml的血液，再加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。注意： 使用底部帶有棱角的離心管，以防倒上清時(shí)，沉淀滑出離心管。

如果血液體積超過1/2離心管的體積，可分兩次進(jìn)行處理。目的：buffer MG-A的作用是快速裂解細(xì)胞，并且促使DNA形成容易沉淀的凝聚物。加入1ml的buffer MG-A。Vortex充分震蕩，10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。加入1ml的buffer MGS, Vortex充分震蕩，10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。將離心管倒扣在吸水上2min；或者簡短離心，仔細(xì)吸除殘留的上清。

目的： 洗滌去除DNA凝聚物中的蛋白。加入1ml buffer MGL和10ul Proteinase K，Vortex震蕩懸浮沉淀。6 65℃水浴30min（或者更長時(shí)間，可過夜），間斷搖晃混合。目的：降解蛋白，釋放DNA 10000xg 離心 30s，將上清緩慢倒入一個(gè)干凈的2ml的離心管，加入800ul 80%異丙醇；緩慢翻轉(zhuǎn)離心管20次（出現(xiàn)絲狀或簇裝DNA凝聚物）,再劇烈搖晃20次使DNA凝聚物變得更緊密。10000xg 30s，緩慢倒掉上清。

注意： 在出現(xiàn)絲狀或簇狀DNA凝聚物后，需劇烈搖晃去除可能包裹在DNA凝膠中的溶液，不然最后DNA溶解困難，或DNA中有鹽殘留。

在出現(xiàn)DNA凝聚物之前，DNA為溶解狀態(tài)，需要緩慢翻轉(zhuǎn)離心管。目的：異丙醇能夠沉淀DNA 加入1000ul 70% 乙醇，劇烈搖晃20次；10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。

目的：洗滌去除鹽成分。將離心管倒置在干凈的吸水紙上至少5min，或者簡短離心，仔細(xì)吸除殘留的乙醇（勿吸除沉淀）。室溫放置10min或者37℃ 放置5min揮發(fā)乙醇，干燥至DNA沉淀為半濕潤狀態(tài)，無酒精味，效果最佳。目的：干燥揮發(fā)乙醇。加入至少200ulTE，提速Vortex 震蕩5s或者劇烈搖晃10次，65℃水浴10-60min 溶解DNA，水浴5min后輕彈離心管底部打散DNA凝聚物（一般繼續(xù)水浴10min 后即可完全溶解）；或者65℃水浴過夜。

注意：水浴后，DNA為溶解狀態(tài)，應(yīng)避免劇烈操作。目的：溶解DNA。