第一篇：PCR擴增過程中污染的預防與對策

pcr技術是聚合酶鏈反應，該技術可將極微量的靶dna特異的擴增上百萬倍，從而大大提高對dna分子的分析和檢測能力。pcr反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，操作復雜，所以在其操作過程中常有污染發(fā)生，即使極少量的污染也會造成假陽性，稍有差錯就會出現(xiàn)假陰性。

本文討論pcr擴增過程中污染的預防與對策。操作者必須熟練掌握技術，嚴格按操作規(guī)程操作，防止假陽性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

污染的原因調(diào)查

標本間的污染；采集標本的容器被污染；提取過程中加樣槍污染；試劑的污染；提取過程中氣溶膠的污染等。

防止污染的預防與對策

實驗人員要熟練掌握pcr操作技術，嚴格規(guī)范操作程序，操作過程中加樣槍的使用，手套、槍頭、離心管應一次性使用。嚴格按試劑生產(chǎn)廠家提供的程序進行操作。

嚴把質(zhì)量關，在操作當中總結(jié)，馬上到期的試劑或剛過期試劑對pcr結(jié)果影響很大。

設立陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控：陰性質(zhì)控以監(jiān)測試劑是否污染，陽性質(zhì)控以監(jiān)測pcr反應是否成功，產(chǎn)物大小是否合本理論要求。

實驗室設置及設備的規(guī)范化

實驗室劃分為4區(qū)：試劑準備區(qū)、，標本準備區(qū)、pcr循環(huán)擴增區(qū)、檢測區(qū)。擴增儀的設置要符合要求，取樣器刻度準確，減少pcr循環(huán)次數(shù)，只要pcr產(chǎn)物過剩檢測水。

近年來pcr技術已普及到各基層醫(yī)院，廣泛地用于感染性病原體，如hbv hcv的臨床檢測，由于缺乏對核酸擴增檢驗技術完整的了解以及缺乏質(zhì)量保證措施，導致部分實驗室結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性的出現(xiàn)，所以操作者必須熟練掌握技術，嚴格按操作規(guī)程操作，防止假陽性，假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

第二篇：臨床基因擴增(PCR)診斷實驗室工作規(guī)范(試行)

附件

2臨床基因擴增（PCR）診斷實驗室工作規(guī)范（試行）

為使基因擴增診斷技術規(guī)范有效的用于臨床，保證檢測質(zhì)量，更好地為臨床疾病的診療服務，特制定本規(guī)范。

1．臨床基因擴增實驗室的設置：和儀器設備

臨床PCR實驗室應分為四個隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應有專用的儀器設備。即1）試劑貯存和準備區(qū)；2）標本制備區(qū)；3）擴增反應混合物配制和擴增區(qū)和的擴增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴增和產(chǎn)物檢測同時完成的熒光定量PCR方法或全自動分析儀如Cobas－T（Anplicor）等，則3）和4）兩個區(qū)可合并。

與上述特定實驗區(qū)有關的各個房間必須有明確的標記，以避免不同工作區(qū)內(nèi)的設備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)必須遵循一嚴格的）順序，只能按單一方向進行，即從試劑貯存和準備區(qū)～標本制備區(qū)～擴增反應混合物配制和擴增區(qū)～擴增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來區(qū)別。此外，當工作人員離開各工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

1．l．試劑貯存和準備區(qū)

本區(qū)用于貯存溶液的制條、溶液的分裝和主反應混合液的制各。本區(qū)儀器設備配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混勻器；（3）微量加樣器若干支（覆蓋1～1000pl）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品；（7）消耗品： 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（8）可移動紫外燈（近工作臺面）。

1．2．標本制備區(qū)

標本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進行。RNA測定時的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設備自己置：（l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三（2）高達臺式冷凍離心機；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量如排器若干支（覆蓋l～1000μl）；（6）專用工作服和工作鞋；（7）專用辦公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（9）可移動紫外燈（近工作臺面）；（10）超凈工作臺；（11）超聲波水?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適用）。

1．3．擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

模板材料（來自標本制備區(qū)）和主反應混合液（來自試劑貯存和準備區(qū)）的加入以及擴增反應等專門在本二．作區(qū)內(nèi)近行。本區(qū)儀器設備自己置：（l）核酸擴增僅三（2）微量加樣器（覆蓋1～1000 μl）；（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。

1．4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)

本區(qū)面積應為6～8m。擴增嚴物的分析在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設備配置：視檢測方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需（l）微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（2）酶標權(quán)、洗報機和恒溫箱;（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。

2．臨床基因擴增診斷實驗室質(zhì)量保證

臨床基因擴增診斷實驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴增檢測的所有階段，即測定分析前的標本來集處理、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。

2．1．標本的采集

常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用時無需進一步預處理。當使用非密鬧采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采禪，必須注意防止來自來樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣者采樣時起碼要談．一次性手套?？芍貜褪褂玫牟Ａ鳌矐邏禾幚?，因為玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要來源是實驗人員的手。最好是熱滅菌，250 烘烤 4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用于RNA（如HCV RNA）測定的血標本最好進行抗凝處理，并盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。

2．2．標本的穩(wěn)定化處

DNA分析，標本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應及時送到實驗室。由于RNA易于降解，因此用于RNA測定的標本的穩(wěn)定化處理有時是必不可少的，Chaotropic物質(zhì)[特別是異硫氨酸抓鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿加入含有GITC的試劑管中進行穩(wěn)定化處理。GITC可使RNAse不可逆失活的適合濃度為5mol/L。如果GITC濃度小于 4mol／L；RNA會很快降解。在適當?shù)姆€(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。如果溫度低于室溫，GITC即會結(jié)晶，所以在加入標本前應使之完全溶解。如標本不能及時送到實驗室，最好選用 GITC處理方法以穩(wěn)定標本。

2．3標本的運送

標本來集后應盡快送至實驗室，經(jīng)過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血標本及用于 RNA提取的經(jīng) GITC 穩(wěn)定化處理的標本。是否冷藏取決于標本的用途，較長時間在室溫貯存會導致靈敏度大大降低。通常應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果在未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

2．4．標本的貯存

臨床體液標本如血清／血漿等可于-70 下長時間貯存。用于DNA測定的核酸樣本應在 10mmol／L Tris，lmmol／L EDTA緩沖液（pH 7．5－8．0）中 4 保存。用于RNA測定的核酸樣本應在緩沖液中一80 C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用 GIT（：穩(wěn)定化處理的 RNA標本在室溫可保存 7天，如貯存時間較長，則RNA測定敏感性略有下降。

2．5．標本的處理（核酸提?。?/p>

核酸提取是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能來源于標本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中確．留的有機溶劑（如酚、氯份等），這些物質(zhì)對其后的酶反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。如在 HBVDNA PCR測定中。采用對血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時，肉眼觀察不明顯的溶血也會對擴增測定有很強的抑制作用，應使用正規(guī)的核酸提取方法（如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。當標本為疾時，則必須先進行液化處理。再提取核酸。需注意的是；液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為 RNA時，降解是一個主要問題。RT－PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前來經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果沒．現(xiàn)RNA降解的證據(jù)。實驗室則應拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導。對于后者，建議常規(guī)使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。

2．6靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴增

2．6.l靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄

cDNA合成為RT-PCR中的第一個酶反應步驟，所產(chǎn)生的 cDNA為靶RNA的反向互補鏈。為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：

l）RT活性的降低或完全缺乏。必須排除由于酶質(zhì)量不高、試劑降解或加樣錯誤而引起的 cDNA合成不充分。

2）RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物（如酚、血紅素）。當RNA明顯為完整而沒有擴增時，應懷疑有此類抑制物。

3）RNA的降解。

2．6．2影響擴增的因素

有多種因素可引起PCR的假陽性或假陰性結(jié)果，如抑制劑或酶活性喪失（見上）、遲大溫度不對、晚十十濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。反應孔中熱傳導的均一性極為重要，循環(huán)儀的溫度控制和加熱塊中熱傳導的一致性必須有常規(guī)的檢查以避免假陰性結(jié)果。

2．7污染

在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：PCR片段的污染（產(chǎn)物污染）三天然基因組DNA的污染；試劑污染（貯存液或工作液）：以及交及污染（如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本）。對于所有的擴增技術，由于圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。一旦發(fā)生了污染，實驗就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止。如果沒有例外，實驗結(jié)果必須作廢，即使平行的污染質(zhì)控中僅有一管顯示出有PCR片段污染。

2．7．l．測定分析前的污染源。

測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。

2．7．2．測定分析階段的污染源。

通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如今血清白蛋白，明腋成礦物油）；商品酶制劑；消耗品（如反應管，吸頭）和實驗設備（如加樣器、離心機）。污染的來源之一是許多樣本在同時制備時的交及污染，但最主要的污染來源為以前擴增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。在前面三個工作區(qū)中，不當?shù)膶嶒灢僮?/p>

會引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒炘O備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當吸取PCR產(chǎn)物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定并嚴格執(zhí)行標準操作程序。

2．7．3．污染的避免。

要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述工作區(qū)的嚴格劃分的目的正是為了預防污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP：從而產(chǎn)生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破壞來自以前測定的擴增產(chǎn)物，從而避免其對將要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化；單產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這些方法也能防止污染。由于上面提到的方法會給人一種假的安全感，所以不能以其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然 DNA的污染。

2．7．4．去除污染的措施。

工作完后必須定期采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：用100ml／L次氨酸鈉清潔表面；試驗了后長時間的紫外照射實驗操作臺和其他表面；實驗設備如加樣器的高壓消毒。

2．8．擴增產(chǎn)物的分析

擴增產(chǎn)物的測定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點印跡、雜交、測序、分光光度法定量等。但臨床PCR測定項目基本上都使用探針雜交方法。

2．8．l．與雜交檢測有關的干擾。

雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的尊核普酸和體外的轉(zhuǎn)錄本（反義 RNA探針）。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴增后的雜交檢測中，應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性。還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高潤度和／或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑是避免假陽性和假陰性結(jié)果的先決條件，要注意的是，溫度和離子強度不能同時改變。

2．9．質(zhì)量控制

如上所述，應該開展各種質(zhì)控來評價測定分析當中各步驟的質(zhì)量，如RNA的完整性、對擴增是否合適和敏感。

2．9．1．室內(nèi)質(zhì)量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準確性。由于PCR測定的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、實驗材料的準備、PCR本身和實驗中的每一步都要求有質(zhì)控。擴增反應前后的酶反應各步也應有質(zhì)控，只不過在質(zhì)控細節(jié)上稍有不同。

2．9．1．1．與實驗材料的準備有關的質(zhì)控。

對DNA提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來檢測?？芍崛〉腄NA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為～100kb，用適合PCR的DNA

提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30�40kb。然而；明顯出現(xiàn)降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分離和用溴化乙錠染色后也可見有強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，好的 DNA提取物，A260/A280 比值應該在 1． 75--2．0之間；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。

最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點跟DNA分離相同，然而，如果對結(jié)果產(chǎn)生懷疑，就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA(28S、18s和 5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或出現(xiàn)帶的缺失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實驗室內(nèi)的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光電比色不能對RNA的完整性下結(jié)論。

2．9．1．2．對cDNA合成和擴增的質(zhì)控。

本部分包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

2．．9．l．2．l．cDNA的合成。

對CDNA合成的效率進行監(jiān)控的關鍵性的質(zhì)控是使用一個內(nèi)反應質(zhì)控。cDNA的合成可以從存在子每一個RNA提取物中的cRNA 轉(zhuǎn)錄本開始(即普遍表達的mRNA，如核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄本這一類的所謂的管家基因），也可從在制備時加入樣本中的作為內(nèi)標準的 RNA開始。cDNA合成的內(nèi)質(zhì)控是能夠產(chǎn)生確定產(chǎn)物的陽性質(zhì)控；如果擴增不成功，質(zhì)控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過程中錯誤啟動或酶活性喪失。

加入確定量的擴增質(zhì)控物可以檢測RT�PCR的靈敏度。對于RT－PCR方法 所必須的污染質(zhì)控為無逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的陰性質(zhì)控。

2．9．1．2．2．PCR反應。

內(nèi)反應質(zhì)控是陽性質(zhì)控?？墒褂脤τ袡C體存活所必須的靶基因作質(zhì)按，這些基因至少以豐臺子狀態(tài)存在，因為如果基因組缺失這些基因，將使有機體致死（所謂的致死因子），一個比較好的例子就是維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因；在世界范圍內(nèi)的許多種族已發(fā)現(xiàn)其廣泛的多態(tài)性，并且還沒有發(fā)現(xiàn)基因活性的同源性丟失，因此，通過PCR共同擴增這種基因的一個片段，在所有患者中均可獲得成功，并且也會證明擴增反應是成功的。

在測定血清／血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清／血漿作為質(zhì)控樣本，與持測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷擴增檢測的有效性。

使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴增反應液的質(zhì)量，還可獲得有關PCR檢測下限和特異性的信息。這些質(zhì)控必須使用與診斷實驗（即患者的標本）所使用的相同的主反應混合液。如果懷疑方法的檢測下限不足以檢測出產(chǎn)物時，則每一個反應管都必須加擴增質(zhì)控。

外加陰性質(zhì)控（污染質(zhì)控）在每一個PCR實驗中都必須設有，應該包括幾種陰性質(zhì)控。通常，這些質(zhì)控是民來指明PCR過程中污染出現(xiàn)的階段。包括在樣品制備的整個過程中所帶的空白反應管、含有樣品制備時所用的所有反應液但不含可擴增的模板（所謂的模擬制備）的反應管等。模擬質(zhì)援可以評估PCR實驗的綜合質(zhì)量。

此外，為對吸樣過程進行質(zhì)控，可以水質(zhì)控樣本來代替核酸樣本加入至反應管，反應管中含所有的反應成分。實際工作中僅通過水樣本來檢測污染是否存在的方法是不可取的，因為它不能發(fā)現(xiàn)樣本處理過程中的污染源，水僅可作為擴增試劑的質(zhì)控。

在擴增靶RNA的PCR實驗中，應做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴增的DNA片段所引起的污染。

2．9．l．3．對測定結(jié)果評價的質(zhì)控．

2．9．1．3．1．板上來交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控。

在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中使用了不同雜交條件而造成的對結(jié)果的錯誤解釋。

2． 9． 2．室間質(zhì)量評價能力驗證，proficiency testing）

所有開展臨床基因擴增檢測的實驗室都應參加由衛(wèi)生部臨床控驗中心組織的全國臨床基因擴增項目的空間質(zhì)量評價，并作為開展臨床基因擴增診斷的依據(jù)之一。

本工作規(guī)范自公布之日起實施。

衛(wèi)生部醫(yī)政司

第三篇：16sRNA PCR 擴增及凝膠電泳分析實驗報告

16sRNA PCR 擴增及凝膠電泳分析

微生物學20092474王紫楓

一、實驗目的1．熟悉細菌活化及培養(yǎng)過程

2．掌握PCR擴增技術及方法

3．掌握凝膠電泳分析技術

二、實驗原理

rRNA進化緩慢，具有高度保守性。不同微生物的rRNA的基因序列在某些位點以不同的幾率發(fā)生突變。同時，小核糖體亞基16sRNA分子量大，攜帶信息量大，可作為屬種鑒定的基礎。

通過篩選的細菌，做活化培養(yǎng)后，細菌在緩沖液酶解，通過細胞破壁、裂解、離心得到RNA相關序列，在經(jīng)過設定PCR相關條件。溫度、循環(huán)次數(shù)，將裂解液加入到體系中進行擴增。在完成循環(huán)后進行凝膠電泳、拍照、序列分析。

三、實驗用品

供試菌種53種、編號試管每株兩個LB固體和液體培養(yǎng)基、Mg2+、無菌水、EB Buffer、TE離心管、移液槍

四、實驗步驟

1．將供試菌株編號，沒人分得3個菌株。

2．將菌株接入固體培養(yǎng)基進行活化，培養(yǎng)24小時。

3．將活化后的菌株挑一環(huán)，接入5ml液體培養(yǎng)基內(nèi)振蕩培養(yǎng)16小時得到菌懸液。

4．取1.5ml菌懸液于離心管，10000轉(zhuǎn)5分鐘棄上清。

5．用無菌水洗滌一次，沉淀懸浮于150ul TE Bufler。

6．將上述懸液在沸水上煮10分鐘，水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)5分鐘離心后，上清液于-20℃保存。

7．取上述上清液1ul于PCR中。

8．3小時PCR擴增。

9．將擴增后的序列取1ul于EB，并注入電泳槽中。

10． 經(jīng)過電泳后的凝膠，取出于紫外熒光燈中顯色，拍照并分析。

五、實驗結(jié)果

經(jīng)過拍照，僅有2、3、6、9、22、38、39、40號擴增出了新的序列顯色明顯。其他沒有擴增出來的原因可能是提取過程中丟失。另外第三塊膠板沒有明顯變化的主要原因可能是電泳時入緩沖液使用了舊的緩沖液，并未出現(xiàn)預期的結(jié)果。

六、注意事項

1．預制固體培養(yǎng)基瓊脂要加夠量，否則很難凝固。

2．在轉(zhuǎn)接時，挑取的一環(huán)盡量多一些，肉眼可看見的狀態(tài)為宜，生長期長一些。

3．緩沖液先用現(xiàn)配。

第四篇：實驗四 PCR擴增基因特異片段

實驗四

PCR擴增基因特異片段

一、實驗目的

1、學會PCR儀的使用方法。

2、掌握PCR反應的實驗技術。

二、實驗原理

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）簡稱PCR。聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈式反應又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。

GLBI蛋白是玉米胚中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，其編碼基因glb1位于第一染色體長臂，基因表達僅限于種子組織。該蛋白對于幼苗生長與存活并非必需。本實驗擴增glb1基因部分序列，全長1200bp左右。

真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 種,它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列,相互之間由間隔區(qū)分隔。其中18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守,適合于較高等級水平的生物群體間的系統(tǒng)分析, 其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)，本實驗擴增榨菜黑斑病ITS序列，序列全長500kb左右。

三、實驗儀器及藥品耗材

1、主要儀器：移液器、振蕩器、PCR儀、電子天平、量筒、微波爐、電泳儀、水平電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)等。

2、主要藥品及耗材：一次性手套、PCR板、移液器吸頭、無菌水、2×PCR 混合酶（Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成的混合液）、液體石蠟、瓊脂糖、0.5×TBE緩沖液、Goldview染料、DNA Marker 2000和溴酚藍等。

四、實驗步驟

（一）PCR擴增玉米目的基因glb1

1、在PCR管中配制25ul反應體系 雙蒸水 8.5ul 2×PCR 混合酶

12.5ul 正向引物ul 反向引物 1 ul DNA 2 ul 液體石蠟 20 ul

2、按一下程序進行擴增 94℃預變性5 min，1個循環(huán)；

94℃變性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，共設35個循環(huán)； 72℃延伸10 min； 4℃保存

(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果

配制1%瓊脂糖凝膠，在25ul PCR擴增產(chǎn)物加1ul溴酚藍，200伏，200毫安，電泳并觀察結(jié)果。

五、作業(yè)

繪畫出PCR擴增電泳圖，標明DNA Marker 位置及檢測PCR產(chǎn)物位置，并根據(jù)DNA Marker位置及亮度估算PCR擴增產(chǎn)物的大小及濃度。

第五篇：臨床中PCR擴增的實驗室設計

臨床基因擴增（PCR）實驗室設計

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介紹了什么叫做基因擴增實驗室以及基因擴增實驗室是如何保證實驗結(jié)果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風空調(diào)系統(tǒng)設計、污染的預防與控制幾個方面探討了基因擴增實驗室設計的主要特點和應注意的問題。

★概述

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此被臨床醫(yī)生廣為認可，已廣泛應用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結(jié)果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局，空調(diào)通風系統(tǒng)設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設計中的主要特點進行了闡述。臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調(diào)通風系統(tǒng)設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進說明。

PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

實驗室通風空調(diào)系統(tǒng)設計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。1.試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。2.標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

3.擴增反應混合物配制和擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內(nèi)進行。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。

本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。

污染的預防與控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。1.工作區(qū)域的嚴格劃分

（1）各個實驗區(qū)域設置合理；

（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如，醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。2.合理的系統(tǒng)設置

（1）合理的空調(diào)通風系統(tǒng)設置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。3.規(guī)范的操作（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經(jīng)培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；

（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。4.嚴格的管理

（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；

（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如，不同顏色），當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（5）擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應特別注意實驗人員的安全防護。

5.完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應的設備和儀器，如，超凈工作臺、離心機、加樣器等。