第一篇：解讀個體化醫(yī)學(xué)檢測與實驗室自建試劑方法

解讀個體化醫(yī)學(xué)檢測與實驗室自建試劑方法 李金明

個體化醫(yī)學(xué)（personalized medicine）通俗顧講，就是疾病的治療“因人而異”的醫(yī)學(xué)，確切地說，是根據(jù)每個患者的個體特征制定相應(yīng)的治療策略的醫(yī)學(xué)，但并不意味著對每個病人都準(zhǔn)備一套藥物或設(shè)立一套治療設(shè)備，而是根據(jù)患者對特定疾病的易感性以及對特定治療的應(yīng)答程度進(jìn)行分類治療，使得預(yù)防或治療性的干預(yù)措施能集中于確定會受益的人群，從而為那些不會受益的人群節(jié)省醫(yī)療開支并減少藥物的副反應(yīng)。

個體化醫(yī)學(xué)檢測則是為疾病的個體化治療決策服務(wù)的，也就是通過實驗室檢測，確定患者是否會對特定的治療產(chǎn)生有效的應(yīng)答。2003年人類基因組計劃基本完成后，進(jìn)入到后基因組時代，功能基因組的研究，揭示了占人類基因組約1%的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）不但決定個體的“高矮胖瘦”等外在特征，也決定了個體對外在刺激應(yīng)對能力以及進(jìn)入機(jī)體的化學(xué)物質(zhì)如藥物等的代謝能力，于是產(chǎn)生了藥物基因組學(xué)。

各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的深入基出研究，產(chǎn)生了疾病的靶向治療概念，各種靶向治療藥物研發(fā)的跟進(jìn)，使得靶向治療成為現(xiàn)實，但靶向治療的有效性又與相應(yīng)基因結(jié)構(gòu)的改變、表達(dá)以及代謝密切相關(guān)。因此，進(jìn)行相應(yīng)基因及結(jié)構(gòu)改變以及基因表達(dá)等的檢測是相關(guān)檢測的基礎(chǔ)，在分子水平上做出臨床診斷，從而增加診斷的準(zhǔn)確性并根據(jù)患者的遺傳特征選擇合適的治療方法，這就是個體化醫(yī)學(xué)檢測，其意義通俗地講，就是決定特定的治療藥物或方法是否能用或用多用少。

個體化醫(yī)學(xué)檢測目前國內(nèi)既有經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的商品試劑，也有實驗室自建試劑方法（laboratory developed tests，LDTs），但實驗室對LDTs、性能驗證（verification）和性能確認(rèn)（validation）等概念通常比較模糊，如何去做性能驗證和性能確認(rèn)，以及在什么情況下做，性能驗證的合格判決斷標(biāo)準(zhǔn)等，也不清楚。本文特就上述方面談一點(diǎn)個人的理解和思考。

一、國內(nèi)個體化醫(yī)學(xué)檢測現(xiàn)狀及特點(diǎn)

近幾年來，國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實驗室已開展了一些涉及腫瘤靶向治療基因突變和藥物代謝基因多態(tài)性檢測等個體化醫(yī)學(xué)檢測項目，并呈快速增加之勢，有以下幾個方面的特點(diǎn)。

1、采用的技術(shù)平臺多

以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的技術(shù)為主，如實時熒光PCR方法（包括擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法[Amplification Refractory Mutation System，ARMS]、PCR-高分辨溶點(diǎn)曲線分析[HRM]等）、PCR-雜交法（如膜上、芯片[基因芯片]、乳膠顆粒[Luminex]）、PCR-質(zhì)譜、PCR-Sanger測序、PCR-焦磷酸測序、PCR-新一代高通量測序等，其它較為常用的還有熒光原位雜交（FISH）和免疫組化等。

2、涉及的臨床科室多

目前國內(nèi)開展個體化醫(yī)學(xué)檢測的臨床實驗室所涉及的科室非常多，因為個體化藥物治療研究進(jìn)展日新月異，可考慮采用基因檢測來決定藥物使用的藥物名單越拉越長，幾乎涉及所有臨床科室，只要相應(yīng)科室的主任有相應(yīng)知識和意識，也有實驗室，就有可能去開展相關(guān)檢驗項目。因此，國內(nèi)目前開展個體化醫(yī)學(xué)檢測項目的實驗室大部分在非檢驗科的其它科室或臨床科室的研究實驗室，如病理科、藥劑科、婦產(chǎn)科、腫瘤科、心胸外科、眼科、耳鼻喉科、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心、中心實驗室、醫(yī)療機(jī)構(gòu)研究所和醫(yī)學(xué)檢驗所等。

3、自配試劑多

個體化醫(yī)學(xué)檢測盡管已有一些國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的檢測試劑，涉及約30余個檢驗項目，但仍有許多實驗室所使用的試劑為自配試劑或方法為自建方法，即LDTs，如幾乎所有PCR-Sanger測序、PCR-限制性長度片段多態(tài)性分析（RFLP）、PCR-質(zhì)譜和PCR-高通量測序等。此外，有許多實驗室對商品試劑盒的組份及操作進(jìn)行了改變，一旦出現(xiàn)這種改變，所用試劑即應(yīng)被視為LDTs。還有，如果使用無證商品試劑，也屬于LDTs。所以LDTs目前應(yīng)可以分為三類：（1）實驗室通過購買試劑盒原材料如引物、探針、擴(kuò)增緩沖液、酶等，配制的自用試劑；

（2）實驗室購買的是經(jīng)過批準(zhǔn)的商品試劑，但對試劑盒組份或操作過程進(jìn)行了改變；

（3）實驗室購買的是未經(jīng)過批準(zhǔn)的無證商品試劑。

二、國內(nèi)外對體外診斷產(chǎn)品和LDTs管理

在北美和歐洲，涉及人類基因的個體化醫(yī)學(xué)檢測，極少有經(jīng)過批準(zhǔn)的商品試劑盒或檢測系數(shù)統(tǒng)，絕大部分都是由醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過使用LDTs來完成的。在美國，1976年的聯(lián)邦食品、藥品和化妝品醫(yī)學(xué)產(chǎn)品法案修正案（The 1976 Medical Device Amendments to the Federal Food，Drug and Cosmetic Act，F(xiàn)D&CA)授權(quán)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）監(jiān)管包括體外診斷產(chǎn)品（in vitro diagnostic devices，IVDs）在內(nèi)的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。IVDs定義為用于疾病診斷或包括為治療或預(yù)防疾病確定患者健康狀態(tài)的其它目的的試劑、儀器和系統(tǒng)，為作為商品銷售。根據(jù)其對患者的風(fēng)險評估分為三類，I類為低風(fēng)險，用于患者前，不需要評估或批準(zhǔn)；Ⅱ類為中度風(fēng)險，而進(jìn)行一般和特定的控制，常需通過進(jìn)入市場前的告知方式或者510（K）過程由FDA進(jìn)行評估；Ⅲ類為高風(fēng)險，則需要進(jìn)入市場前的批準(zhǔn)（premarket approval，PMA）程序。一般的藥物遺傳檢測屬于Ⅱ類。加拿大則將IVDs的風(fēng)險分為四級，遺傳檢測歸為Ⅲ類，即對公眾健康有中等風(fēng)險或?qū)€體有高風(fēng)險。歐盟則制定了“體外診斷醫(yī)學(xué)產(chǎn)品指令”（the In Vitro Diagnostic Medical Devices Directive[Council Directive 98/79/EC]），作為歐盟的IVDs監(jiān)管的要求，設(shè)定了最低安全、質(zhì)量和性能標(biāo)準(zhǔn)，但具體評價由成員國的監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行，一旦通過一個國家的批準(zhǔn)，則全歐盟成員國通行有效。在國內(nèi)，IVDs的監(jiān)管由國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）負(fù)責(zé)，管理法規(guī)是以國務(wù)院令形式發(fā)布《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》，同樣，IVDs按低、中和高風(fēng)險分為三類，第一類實行產(chǎn)品備案管理，第二類、第三類實行產(chǎn)品注冊管理。二類由省級藥監(jiān)部門負(fù)責(zé)注冊，三類由CFDA負(fù)責(zé)注冊。

相對于IVDs，臨床實驗室為疾病診斷和治療進(jìn)行實驗室檢測及報告結(jié)果，在美國應(yīng)遵循“1988年的臨床實驗室改進(jìn)修正案（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA)，具體由美國醫(yī)療保險和醫(yī)療補(bǔ)助中心（the Centers for Medicare& Medicaid Services，CMS）監(jiān)管，遵循CLIA要求對實驗室檢查、認(rèn)證和認(rèn)可由CMS或獨(dú)立的授權(quán)機(jī)構(gòu)如病理學(xué)家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）負(fù)責(zé)。CLIA關(guān)注的是檢測過程的準(zhǔn)確性和可靠性，以及質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價（能力驗證）、實驗室檢測人員的證書、報告結(jié)果的要求和標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）文件，實驗室負(fù)責(zé)人起著核心作用。作為CLIA的一部分，F(xiàn)DA將實驗室檢測根據(jù)其復(fù)雜程度分為豁免、中度和高度復(fù)雜三類，CLIA再針對這三類檢測提出不同的管理要求。CLIA允許臨床實驗室修改FDA批準(zhǔn)的診斷產(chǎn)品以及研發(fā)其自己實驗室的檢測，亦即LDTs。在CLIA規(guī)則下的定期檢查確保LDTs遵循必要的程序，并且LDTs檢測只能是在執(zhí)業(yè)醫(yī)生、實驗室科學(xué)家、遺傳學(xué)家和分子病理學(xué)家等實驗室專家的指導(dǎo)下進(jìn)行。在美國絕大部分的基因遺傳相關(guān)檢測均采用LDTs，歐洲亦如此，但歐洲LDTs只適用于政府的公共醫(yī)療機(jī)構(gòu)實驗室，可免于IVD Directive監(jiān)管，只能在自己實驗室使用，如要提供給其它機(jī)構(gòu)實驗室，則需要走監(jiān)管程序。國內(nèi)針對LDTs在2000年發(fā)布的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務(wù)院令第276號）中的第十條規(guī)定，醫(yī)療機(jī)構(gòu)根據(jù)本單位的臨床需要，可以研制醫(yī)療器械，在執(zhí)業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下在本單位使用。2014年新發(fā)布的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務(wù)院令第650號）刪去了這一條，但并沒有規(guī)定不允許自制醫(yī)療器械。

近些年來，在美國一些商業(yè)實驗室開展了直接針對消費(fèi)者的檢測項目（direct to consumer，DTC），主要是一些疾病風(fēng)險預(yù)測的項目，均為LDTs。因為其意義的不明確和結(jié)果解讀的問題，對被檢者有可能造成不可預(yù)知的困惑或傷害。例如，美國好萊塢著名女演員茱莉2013年5月14日在美國《紐約時報》發(fā)表了“My Medical Choice（我的醫(yī)療選擇）”一文，她表示自己由于攜帶乳腺癌1號基因（BRCA1），已經(jīng)接受預(yù)防性的雙側(cè)乳腺切除手術(shù)，以降低罹癌風(fēng)險。據(jù)茱莉介紹，自己的母親曾經(jīng)與癌癥作斗爭了近十年，于56歲時去世。由于媽媽給她遺傳了BRCA1基因，因此患乳腺癌和卵巢癌的幾率比較高，分別是87%和50%。因此，美國FDA試圖對LDTs進(jìn)行有限的監(jiān)管，2014年7月再次向美國國會提交議案，在這份提案中FDA計劃按照LDT類型分為I級低風(fēng)險；II級中度風(fēng)險，III級高風(fēng)險，分別對應(yīng)告知（reporting）、注冊（registration）、510(k)認(rèn)證等監(jiān)管要求。對于罕見疾病，以及有巨大的臨床需求，且安全性被證實的診斷技術(shù)，F(xiàn)DA把它劃為I級低風(fēng)險，仍然由CMS監(jiān)管。但也有眾多學(xué)者反對，提出FDA是管診斷產(chǎn)品的，而臨床實驗室研發(fā)LDTs提供的只是一種醫(yī)學(xué)服務(wù)，并非產(chǎn)品。但強(qiáng)調(diào)LDTs在臨床應(yīng)用前，應(yīng)有嚴(yán)格的性能確認(rèn)程序，使用中有嚴(yán)格的質(zhì)量控制和使用情況監(jiān)控。國內(nèi)LDTs如何能有效地為臨床服務(wù)，如何進(jìn)行管控是值得業(yè)界思考的一個問題。

三、性能驗證和性能確認(rèn)

為保證檢驗質(zhì)量，臨床實驗室在正式開展日常檢測之前，應(yīng)對其檢測試劑方法或系統(tǒng)進(jìn)行性能驗證（verification）或性能確認(rèn)（validation）。性能驗證在廣義上的概念是指通過提供客觀證據(jù)證明特定的要求得到滿足。而美國的CLIA中的性能驗證術(shù)語特指使用某特定檢測試劑或系統(tǒng)的實驗室按照所提供的試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書使用時，能復(fù)現(xiàn)生產(chǎn)廠家所宣稱的檢測性能。說明性能驗證特指針對經(jīng)批準(zhǔn)的商品試劑或檢測系統(tǒng)，其所要驗證的是在特定的實驗室條件（環(huán)境、人員、標(biāo)準(zhǔn)操作程序）下的檢測性能指標(biāo)是否與試劑盒說明書上所標(biāo)示的是一致的。因此，對各項檢測性能指標(biāo)如精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性等的驗證是否合格的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以試劑盒說明書為準(zhǔn)，如何進(jìn)行性能驗證也可按試劑盒說明書中相應(yīng)性能指標(biāo)確立時的方法進(jìn)行，但可以適當(dāng)簡化。而性能確認(rèn)（validation），美國FDA和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）均將其定義為，通過檢查和提供客觀證據(jù)證明，對一特定預(yù)期用途（intended use）的要求始終能得到滿足。性能驗證和性能確認(rèn)在美國FDA和ISO術(shù)語相似，差異在后者的“預(yù)期用途”。比如說，某實驗室自制了一個表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）18~21號外顯子基因突變檢測試劑，也就是其預(yù)期用途是檢測上述基因突變，性能確認(rèn)就是通過實驗所提供的客觀證據(jù)證明該試劑是否能正確的且可重復(fù)地檢測到相應(yīng)基因突變。世界衛(wèi)生組織（WHO）則將“性能確認(rèn)”定義為，證明所使用的一個程序、過程、系統(tǒng)設(shè)備或方法能按預(yù)期進(jìn)行工作以及取得預(yù)期結(jié)果的活動（或過程）。因此，“性能確認(rèn)”可用來指在測定方法研發(fā)時，建立的分析性能特征。由上述可見，“性能驗證”要驗證的是商品試劑盒說明書中所列出的性能驗指標(biāo)如精密度（重復(fù)性）、準(zhǔn)確度、測定范圍、線性范圍（定量）、分析敏感性、分析特異性、抗干擾能力等是否在特定實驗室條件下是否可以復(fù)現(xiàn)。而“性能確認(rèn)”為LDTs建立上述性能指標(biāo)，從而證明其能滿足相應(yīng)的應(yīng)用目的。

第二篇：分子生物學(xué)實驗室常用試劑的配制方法

一.常用貯液與溶液

1mol/L亞精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。

1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：將77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔徑的濾膜過濾除菌。

10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（組分V或分子生物學(xué)試劑級，無DNA酶）于9.5ml水中（為減少變性，須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白），蓋好蓋后，輕輕搖動，直至牛血清蛋白完全溶解為止。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）：在二硫蘇糖醇5g的原裝瓶中加32.4ml水，分成小份貯存于-20℃。或轉(zhuǎn)移100mg的二硫蘇糖醇

至微量離心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫蘇糖醇溶液。

8mol/L乙酸鉀（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸鉀于足量的水中，加水定容到100ml。

1mol/L氯化鉀（KCl）：溶解7.46g氯化鉀于足量的水中，加水定容到100ml。

3mol/L乙酸鈉（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸鈉于約90ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

0.5mol/L EDTA:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。

1mol/L HEPES：將23.8gHEPES溶于約90ml的水中，用NaOH調(diào)pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。

1mol/L HCl：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。

25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份貯存于-20℃。

1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。

100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的異丙醇中，定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹

或貯存于-20℃。

20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：將200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

10mg/mlRnase（無DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）

5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解29.2g氯化鈉于足量的水中，定容至100ml。

10N氫氧化鈉（NaOH）：溶解400g氫氧化鈉顆粒于約0.9L水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至1L。

10％SDS（十二烷基硫酸鈉）：稱取100gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含0.9L的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至1L。

2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使終體積為100ml。

100％三氯乙酸（TCA）:在裝有500gTCA的試劑瓶中加入100ml水，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。（稀釋液應(yīng)在臨用前配制）

2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用鋁箔包裹裝液管，貯存于-20℃。

100×Denhardt試劑（Denhardt's regent）

成分及終濃度

配制100ml溶液各成分的用量

2%聚蔗糖（Ficoll，400型）

2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）

2%BSA（組分V）

水

2g 2g 2g

加水至總體積為100ml

依照上表稱取各組分，溶于水中定容。過濾除菌及雜質(zhì)，分裝成小份于-20℃貯存。

10×標(biāo)準(zhǔn)DNA連接酶緩沖液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端連接）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分的用量

0.5mol/L Tris-HCl 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT 2mmol/L ATP

5mmol/L 鹽酸亞精胺（可選）

0.5mg/ml BSA（組分V）（可選）

水

5ml 1mol/L 貯液

1ml 1mol/L 貯液

1ml 1mol/L 貯液

200ul 100 mmol/L 貯液

50ul 1 mmol/L 貯液

0.5ml 10 mg/mL 貯液

2.25ml

將配制好的緩沖液分裝成小份，貯存于-20℃。

mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions）

可以購買到100mmol/L純dNTPs貯液，-80℃可貯存至少6個月。

10mmol/L dNTP混合液

成分及終濃度

配制20ul溶液各成分的用量

10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP 水

2ul 100 mmol/L dATP 貯液

2ul 100 mmol/L dCTP 貯液

2ul 100 mmol/L dGTP 貯液

2ul 100 mmol/L dTTP 貯液

12ul

20％PEG 8000/2.5M NaCl

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分的用量

質(zhì)量濃度為20％聚乙二醇

2.5mol/L 氯化鈉

水 20g

50ml 5 mol/L 氯化鈉 或 14.6g 固體氯化鈉

補(bǔ)足100ml

加聚乙二醇于含有氯化鈉的燒杯中，加水至終體積100ml，用磁力攪拌器攪拌溶解。

20×SSC

成分及終濃度

配制1L溶液各成分的用量

300mmol/L 檸檬酸三鈉（二水）

3mol/L 氯化鈉

水

88.2g 175.3g 補(bǔ)足1L

溶解檸檬酸三鈉（二水）和氯化鈉于約0.9L水中，加幾滴10N NaOH溶液調(diào)pH為7.0，用水補(bǔ)足體積至1L。

DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水

加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的體積分?jǐn)?shù)為0.1％。在37℃溫浴至少12h，然后在15 psi 條件下高壓滅菌20min，以使殘余的DEPC失活。DEPC會與胺起反應(yīng)，不可用DEPC處理Tris緩沖液。

甲酰胺（deionized formamide）

直接購買或加Dowex XG8 混合樹脂于裝有甲酰胺的玻璃燒杯中，用磁力攪拌器輕輕攪拌1h，可去除甲酰胺中的離子。經(jīng)Whatman 1號濾紙過濾除去樹脂后分成小份，充氮?dú)庥?80℃貯存（防止氧化）。

磷酸緩沖液（phosphate buffer）

按照下表所給定的體積，混合1 mol/L 的磷酸二氫鈉（單堿）和1mol/L 磷酸氫二鈉（雙堿）貯液，獲得所需pH的磷酸緩沖液。配制1 mol/L 的磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）貯液：溶解138g于足量水中，使終體積為1L;1mol/L 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）貯液:溶解142g于足量水中使終體積為1L。

1mol/L 磷酸二氫鈉（ml）

1mol/L 磷酸氫二鈉（ml）

最終pH值

877 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 123 150 185 225 265 315 375 435 490 550 610 670 720 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2

TE（用于懸浮和貯存DNA）

成分及終濃度

配制100ml溶液各成分的用量

10mmol/L Tris－HCl 1mmol/L EDTA 水

1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃）

200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）

98.8ml

Tris緩沖液（Tris-HCl buffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。

濃鹽酸的體積（ml）

pH

8.6 14 21 28.5 38 46 56 66 71.3 76 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2

二.電泳緩沖液、染料和凝膠加樣液

電泳緩沖液

50×Tris-乙酸（TAE）緩沖液

成分及終濃度

配制1L溶液各成分的用量

2mol/L Tris堿

1mol/L 乙酸

mmol/L EDTA 水

242g

57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）

200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）

補(bǔ)足1L

5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液

成分及終濃度

配制1L溶液各成分的用量

445 mmol/L Tris堿

445 mmol/L 硼酸鹽mmol/L EDTA 水

54g 27.5g 硼酸 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）

補(bǔ)足1L

染料

1％溴酚藍(lán)（bromophenol blue）

加1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解。

1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）

溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。

10mg/ml的溴化乙錠（ethidium bromide）

小心稱取1g溴化乙錠，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加100ml水，用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4℃貯存。

凝膠上樣液（gel loading solutions）

6×堿性凝膠上樣液（室溫貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.3 N 氫氧化鈉mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型）

0.15％溴甲酚綠

0.25％二甲苯青FF 水

300ul 10N 氫氧化鈉

120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

1.8g 15mg 25mg 補(bǔ)足到10ml

6×聚蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚藍(lán)

0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型）

水

1.5ml 1％溴酚藍(lán)

1.5ml 1％二甲苯青FF

100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

1.5g 補(bǔ)足到10ml

6×溴酚藍(lán)/二甲苯青/聚蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.25％溴酚藍(lán)

0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型）

水

2.5ml 1％溴酚藍(lán) 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g 補(bǔ)足到10ml

6×甘油凝膠上樣液（4℃貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚藍(lán)

0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油

水

1.5ml 1％溴酚藍(lán)

1.5ml 1％二甲苯青FF

100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

3ml 3.9ml

6×蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚藍(lán)

0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖

水

1.5ml 1％溴酚藍(lán)

1.5ml 1％二甲苯青FF

100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

4g

補(bǔ)足到10ml

10×十二烷基硫酸鈉/甘油凝膠上樣液（室溫貯存）

成分及終濃度

配制10ml溶液各成分用量

0.2％溴酚藍(lán)

0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油

水

20mg 20mg

4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ul 10％ SDS 5ml 補(bǔ)足到10ml

三.常用培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基

將下列組分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

10g

酵母提取物

5g

氯化鈉

10g

如果需要用1N NaOH（～1ml）調(diào)整pH至7.0，再補(bǔ)足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/L,上層瓊脂平板添加瓊脂粉7g/L。

SOB培養(yǎng)基

將下列組分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

20g

酵母提取物

5g

氯化鈉 0.5g mol/L 氯化鉀

2.5ml

用水補(bǔ)足體積到1L。分成100ml的小份，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻到室溫后，再在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂。

SOC培養(yǎng)基

成分、方法同SOB培養(yǎng)基的配制，只是在培養(yǎng)基冷卻到室溫后，除了在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂外，再加2ml滅菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足夠水中，再用水補(bǔ)足到100ml，用0.22um的濾膜過濾除菌）。

TB培養(yǎng)基

將下列組分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

12g

酵母提取物

24g

甘油

4ml

各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60℃，再加100ml滅菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使終體積為100ml。高壓滅菌或用0.22um的濾膜過濾除菌）。

2×YT培養(yǎng)基

將下列組分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

16g

酵母提取物

10g

氯化鈉

4ml

如果需要用1N NaOH（～1ml）調(diào)整pH至7.0，再補(bǔ)足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/L,上層瓊脂平板添加瓊脂粉7g/L。

YPD培養(yǎng)基

將下列組分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

20g

酵母提取物

10g

葡萄糖

20g

用水補(bǔ)足體積為1L后，高壓滅菌。建議在高壓滅菌之前，對色氨酸營養(yǎng)缺陷型每升培養(yǎng)基添加1.6g色氨酸，因為YPD培養(yǎng)基是色氨酸限制型培養(yǎng)基。為了配制平板，需要在高壓滅菌前加入20g瓊脂粉。

四.常用抗生素

氨芐青霉素（ampicillin）（100mg/ml）

溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

羧芐青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）

溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）

溶解1g甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以37.5ug/ml終濃度與100ug/ml氨芐青霉素一起添加于生長培養(yǎng)基。

卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）

溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）

溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

鏈霉素（streptomycin）（50mg/ml）

溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）

溶解50mg萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以15ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

四環(huán)素（tetracyyline）（10mg/ml）

溶解100mg四環(huán)素鹽酸鹽于足量的水中，或者將無堿的四環(huán)素溶于無水乙醇，定容至10ml。分裝成小份用鋁箔包裹裝液管以免溶液見光，于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

第三篇：【引用】高中生物實驗常用的試劑和檢測方法

【引用】高中生物實驗常用的試劑和檢測方法

(1)化學(xué)物質(zhì)的檢測方法： ①淀粉碘液——

②還原糖、班氏試劑——斐林試劑

③CO2——Ca(OH)2溶液或酸堿指示劑或溴麝香草酚藍(lán)溶液 ④O2——余燼復(fù)燃

⑤蛋白質(zhì)——雙縮脲試劑

⑥染色體、醋酸洋紅溶液——龍膽紫 ⑦DNA——二苯胺試劑 ⑧脂肪蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液—— ⑨酒精——酸化的重鉻酸鉀溶液

(2)實驗結(jié)果的顯示方法：

①光合速率——O2釋放量或CO2吸收量或淀粉產(chǎn)生量 ②呼吸速率——O2吸收量或CO2釋放量或淀粉減少量 ③原子途徑——放射性同位素示蹤法 ④細(xì)胞液濃度大小——質(zhì)壁分離 ⑤細(xì)胞是否死亡——質(zhì)壁分離

⑥甲狀腺激素作用——動物耗氧量，發(fā)育速度等 ⑦生長激素作用——生長速度(體重變化，身高變化)⑧胰島素作用——動物活動狀態(tài)

(3)實驗條件的控制方法：

①增加水中氧氣——泵入空氣或吹氣或放入綠色植物 ②減少水中氧氣——容器密封或油膜覆蓋或用涼開水 ③除去容器中CO2——NaOH溶液

④除去葉片中原有淀粉——置于黑暗環(huán)境 ⑤除去葉片中葉綠素隔水加熱——酒精

⑥除去光合作用對呼吸作用的干擾——給植株遮光 ⑦如何得到單色光——棱鏡色散或彩色薄膜濾光 ⑧線粒體提取——細(xì)胞勻漿離心

⑾滅菌方法——微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵在于滅菌，對不同材料,滅菌方法不同：培養(yǎng)基用高壓蒸氣滅菌；接種環(huán)用火焰灼燒滅菌；雙手用肥皂洗凈，擦干后用75％酒精消毒；整個接種過程都在實驗室無菌區(qū)進(jìn)行。

(4)實驗中控制溫度的方法： ①還原糖鑒定：水浴煮沸加熱 ②酶促反應(yīng)：水浴保溫 ③用酒精溶解葉中的葉綠素：酒精要隔水加熱 ④DNA的鑒定：水浴煮沸加熱

⑤細(xì)胞和組織培養(yǎng)以及微生物培養(yǎng)：恒溫培養(yǎng) 2．斐林試劑、班氏試劑與尿糖試紙

這三種物質(zhì)均可用來檢驗含醛基的有機(jī)物的存在，在醫(yī)學(xué)上用來檢驗糖尿病，其原理均是利用了Cu2+的氧化性把醛基氧化，但成分略有不同：

斐林試劑：即硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉組成的藍(lán)色混合溶液。分為斐林試劑A和斐林試劑B，A為CuSO4溶液，B為氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的混合溶液，使用時將A、B等體積混合即成斐林試劑。

班氏試劑：即硫酸銅、碳酸鈉和檸檬酸鈉組成的混合液，又叫本尼迪克特(Benedict)試劑，它與醛反應(yīng)的結(jié)果是與斐林試劑一致的，只是比斐林試劑更穩(wěn)定，所以在臨床化驗中更常使用。

尿糖試紙：又叫硫酸銅試紙，呈白色,帶藍(lán)色斑點(diǎn)，用于糖尿病患者的尿糖測試。每片含硫酸銅20毫克,枸櫞酸毫克,碳酸鈉80毫克，氫氧化鈉235毫克。尿糖試紙法快速、方便，試紙的正確使用方法為：將試紙條放在尿液中浸濕，一秒鐘后取出，在一分鐘內(nèi)觀察試紙的顏色，并與標(biāo)準(zhǔn)色板對照，根據(jù)不同的顏色來確定尿糖陽性的程度。300 3．斐林試劑和雙縮脲試劑的比較

相同點(diǎn)：①都由NaOH溶液和CuSO4溶液構(gòu)成；

②斐林試劑甲液和雙縮脲試劑A都為0．1g/mLNaOH溶液。

不同點(diǎn)：①CuSO4溶液濃度不一樣：斐林試劑乙液為0．05g/mLCuSO4溶液，雙縮脲試劑B為0．01g/mLCuSO4溶液。

②配制比例不一樣。

③使用方法不一樣：斐林試劑是甲、乙液一起混合后再使用，雙縮脲試劑則是先向待鑒定材料加入A試劑搖勻后，再加入試劑B。

④鑒定的對象不一樣：斐林試劑鑒定的是還原糖，雙縮脲試劑鑒定的是蛋白質(zhì)。⑤反應(yīng)本質(zhì)及顏色反應(yīng)不一樣。4．蘇丹Ⅲ染液與蘇丹Ⅳ染液的比較

都是用來鑒定脂肪。蘇丹Ⅳ染液更易溶于脂肪，所以染色更深，同時要求染色時間更短。生物學(xué)中常用的試劑：

1、斐林試劑： 成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.05g/ml CuSO4（乙液）。用法：將斐林試劑甲液和乙液等體積混合，再將混合后的斐林試劑倒入待測液，水浴加熱或直接加熱，如待測液中存在還原糖，則呈磚紅色。

2、班氏糖定性試劑：為藍(lán)色溶液。和葡萄糖混合后沸水浴會出現(xiàn)磚紅色沉淀。用于尿糖的測定。

3、雙縮脲試劑：成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.01g/ml CuSO4（乙液）。用法：向待測液中先加入2ml甲液，搖勻，再向其中加入3~4滴乙液，搖勻。如待測中存在蛋白質(zhì)，則呈現(xiàn)紫色。

4、蘇丹Ⅲ：用法：取蘇丹Ⅲ顆粒溶于95%的酒精中，搖勻。用于檢測脂肪?？蓪⒅救境砷冱S色（被蘇丹Ⅳ染成紅色）。

5、二苯胺：用于鑒定DNA。DNA遇二苯胺（沸水?。蝗境伤{(lán)色。

6、甲基綠：用于鑒定DNA。DNA遇甲基綠（常溫）會被染成藍(lán)綠色。（甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，吡羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。）7、50%的酒精溶液：在脂肪鑒定中，用蘇丹Ⅲ染液染色，再用50%的酒精溶液洗去浮色。8、75%的酒精溶液：用于殺菌消毒，75%的酒精能滲入細(xì)胞內(nèi)，使蛋白質(zhì)凝固變性。低于這個濃度，酒精的滲透脫水作用減弱，殺菌力不強(qiáng)；而高于這個濃度，則會使細(xì)菌表面蛋白質(zhì)迅速脫水，凝固成膜，妨礙酒精透入，削弱殺菌能力。75％的酒精溶液常用于手術(shù)前、打針、換藥、針灸前皮膚脫碘消毒以及機(jī)械消毒等。9、95%的酒精溶液：冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精可用于凝集DNA。10、15%的鹽酸：和95%的酒精溶液等體積混合可用于解離根尖。

11、龍膽紫溶液：(濃度為0.01g/ml或0.02g/ml)用于染色體著色，可將染色體染成紫色，通常染色3~5分鐘。（也可以用醋酸洋紅染色）12、20%的肝臟、3%的過氧化氫、3.5%的氯化鐵：用于比較過氧化氫酶和Fe3+的催化效率。（新鮮的肝臟中含有過氧化氫酶）13、3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、2%的新鮮淀粉酶溶液：用于探索淀粉酶對淀粉和蔗糖的作用實驗。

14、碘液：用于鑒定淀粉的存在。遇淀粉變藍(lán)。

15、丙酮：用于提取葉綠體中的色素。

16、層析液：（成分：20份石油醚、2份丙酮、和1份苯混合而成，也可用93號汽油）可用于色素的層析，即將色素在濾紙上分離開。

17、二氧化硅：在色素的提取的分離實驗中研磨綠色葉片時加入，可使研磨充分。

18、碳酸鈣：研磨綠色葉片時加入，可中和有機(jī)酸，防止在研磨時葉綠體中的色素受破壞。19、0.3g/mL的蔗糖溶液：相當(dāng)于30%的蔗糖溶液，比植物細(xì)胞液的濃度大，可用于質(zhì)壁分離實驗。20、0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液：與雞血混合，防凝血。

21、氯化鈉溶液：①可用于溶解DNA。當(dāng)氯化鈉濃度為2mol/L、0.015mol/L時DNA的溶解度最高，在氯化鈉濃度為0.14 mol/L時，DNA溶解度最低。②濃度為0.9%時可作為生理鹽水。

第四篇：檢驗科試劑與校準(zhǔn)品管理制度解讀

檢驗科試劑與校準(zhǔn)品管理制度 1.試劑與校準(zhǔn)品采購與儲存的管理

1.1成立試劑管理小組,協(xié)助科主任規(guī)范試劑管理過程中各個環(huán)節(jié)。并指定專人做好試劑的登記入庫、出庫、清點(diǎn)盤存、保管、報廢等工作,做到賬冊實物相符。

1.2請購試劑必須填寫請購單,科主任審查簽字,然后交院采購中心統(tǒng)一采購。1.3各實驗室組長要按實際用量,以保證檢驗質(zhì)量和節(jié)約開支為原則,有計劃地請購試劑,以免造成試劑的無故浪費(fèi)。

1.4試劑進(jìn)貨要做到來源渠道正規(guī)、貨物優(yōu)質(zhì)、有批準(zhǔn)文號、生產(chǎn)日期及供貨單位加蓋紅印的《經(jīng)營許可證》、《生產(chǎn)許可證》、《注冊證》復(fù)印件和法人委托書及業(yè)務(wù)員的身份證明。以上資料統(tǒng)一由采購中心專人登記保管。

1.5驗收試劑時,須核對規(guī)格、批號、數(shù)量,批準(zhǔn)文號。發(fā)現(xiàn)試劑盒破損、試劑溢出及過期試劑一律給予退回。驗收人須在發(fā)票上簽字,并在《試劑驗收登記》上詳細(xì)記錄,然后將發(fā)票交采購中心復(fù)審。

1.6更換試劑品牌應(yīng)向科主任說明理由,由科主任上報采購中心,經(jīng)招標(biāo)、論證擇優(yōu)選用。

1.7自配試劑必須經(jīng)過質(zhì)量檢測或比對后方可使用。試劑標(biāo)簽清楚,整齊,標(biāo)簽上要寫明試劑名稱、濃度、配制日期,配制人、有效期等,特殊保存要注明。1.8實驗用純水每天要用STD儀檢測純度(要求≤0.05ppm。每月采樣一次送微生物室做細(xì)菌培養(yǎng),不合格純水不能用于任何實驗。

1.9各實驗室組長要做好試劑的請購、使用和保存工作,每月底要檢查庫存試劑,防止變質(zhì)、過期和浪費(fèi),并及時請購,以保證日常工作。

1.10不定期的召開試劑管理小組會議,對近期試劑使用中的問題進(jìn)行討論解決,屬試劑質(zhì)量問題應(yīng)及時反饋給采購中心,或及時與廠家溝通解決,必要時更換試劑品牌。

1.11試劑必須與化學(xué)藥品分開存放,存放試劑的冰箱內(nèi)嚴(yán)禁存放個人物品,并每天檢查冰箱溫度、做好記錄。劇毒、易燃、易爆品要按要求保管并由專人負(fù)責(zé)、強(qiáng)酸強(qiáng)堿試劑要單獨(dú)保存。具體參照《易烯、易爆、劇毒等危險品管理制度》。

1.12各實驗室開展新項目需與科主任聯(lián)系,核算試劑成本,選擇優(yōu)質(zhì)試劑品牌。1.13試劑外借一律經(jīng)科主任同意并履行手續(xù)(借條方可執(zhí)行。2.試劑與校準(zhǔn)品使用的管理

2.1使用檢驗試劑與校準(zhǔn)品的人員必須具備臨床檢驗工作資格,非檢驗人員不得擅自使用。

2.2使用檢驗試劑與校準(zhǔn)品,必須如實填寫試劑與校準(zhǔn)品出入庫登記表,以備清點(diǎn)檢查庫存情況,同時在包裝盒上寫明啟用日期。

2.3從事檢驗工作的人員要掌握實驗操作基本知識,認(rèn)真閱讀試劑與校準(zhǔn)品使用說明書的相關(guān)要求,服從實驗室管理人員的安排和指導(dǎo)。

2.4使用試劑與校準(zhǔn)品過程中,必須嚴(yán)格按實驗操作規(guī)程操作,嚴(yán)格執(zhí)行《試劑管理制度》、《實驗室生物安全管理規(guī)范》。

2.5實驗結(jié)束后,應(yīng)對試劑與校準(zhǔn)品的名稱、使用量與剩余量等進(jìn)行核對,確認(rèn)無誤后,放入指定冰箱或指定位置儲存。

2.6工作完成后,檢查實驗室污染情況,造成試劑或校準(zhǔn)品污染的,應(yīng)立即進(jìn)行清潔處理,并做相應(yīng)的記錄。

2.7各專業(yè)組組長負(fù)責(zé)清點(diǎn)試劑與校準(zhǔn)品,庫存不足的及時申請補(bǔ)充,過期失效的及時清理。

2.8試劑管理小組負(fù)責(zé)定期檢查《試劑出入庫登記表》,并統(tǒng)計試劑與校準(zhǔn)品的使用與庫存情況,發(fā)現(xiàn)使用或登記中存在問題的及時向領(lǐng)導(dǎo)及相關(guān)責(zé)任人反饋并協(xié)同解決。

第五篇：動物性病原微生物的實驗室檢測常規(guī)方法簡述

動物病原微生物的常規(guī)實驗室檢測方法簡述

隨著我國動物養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，動物傳染病逐漸呈現(xiàn)出非典型性癥狀和混合感染的征狀日趨嚴(yán)重，許多病例僅靠臨床和病理診斷很難進(jìn)行確診，而實驗室檢測已逐漸成為動物病原微生物確診的依據(jù)。目前，動物病原微生物實驗室檢測經(jīng)常使用的方法主要包括病原學(xué)診斷，血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷。本文對動物病原微生物的實驗室診斷方法進(jìn)行簡要的概括，為實驗室診斷的初學(xué)者提供一些參考。1 病原學(xué)檢測 1.1 涂片鏡檢

對于送檢樣品首先一般要進(jìn)行涂片鏡檢，首先將樣品涂片，然后根據(jù)臨床診斷疑似感染病原情況進(jìn)行染色，常用的染色方法主要有革蘭氏染色、美藍(lán)染色、姬姆薩染色和抗酸性染色法等，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)，得出初步的結(jié)論。對于疑似的病毒性感染需要進(jìn)行電鏡觀察，電鏡是以電子束來代替可見光束，觀察物體時，分辨率就沒有波長要在可見光譜之內(nèi)的限制，因此其放大倍數(shù)和分辨率都比光學(xué)顯微鏡高得多。病毒顆粒極其微小，在17-300nm之間，光學(xué)顯微鏡無法觀察，只有電鏡才可以發(fā)現(xiàn)其形態(tài)。1.2 分離培養(yǎng)

病原分離是病原微生物檢測應(yīng)用較廣泛的方法，細(xì)菌、真菌、螺旋體和支原體需要將樣品處理后接種到其特定的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后劃線或涂到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過其生長形態(tài)、生化特性作出鑒定。立克次體、衣原體、病毒則需要將樣品接種到雞胚或特定的細(xì)胞分離病毒，通過病變情況鑒定病原。分離培養(yǎng)需要的時間較長，且分離的病原可能不是致病主要因素，但是它是病原微生物的基本鑒定方法，是病原學(xué)檢測的基礎(chǔ)。1.3 動物接種

將樣品處理后或分離培養(yǎng)的病原根據(jù)其不同的特性接種對待檢病原敏感的實驗動物，通過觀察其是否發(fā)病和發(fā)病癥狀來進(jìn)行判斷，甚至還可以對發(fā)病實驗動物繼續(xù)分離培養(yǎng)病原。分子生物學(xué)檢測 2.1 PCR

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是目前病原檢測的最常用的分子生物學(xué)技術(shù)，具有高敏感性的特征，即使少量的感染也可以檢出，同時該方法也是許多其它檢測方法的基礎(chǔ)。其原理是將樣品的基因組DNA提出，在加熱條件下，DNA雙鏈變性分離為單鏈，加入合成的保守區(qū)域的特異性引物，在合適的溫度下和耐熱聚合酶的作用下引導(dǎo)DNA的合成，循環(huán)重復(fù)后即可得到大量的目的基因片段，經(jīng)電泳可以檢測。RNA病毒需要提取的是RNA，反轉(zhuǎn)錄生成DNA后再進(jìn)行PCR，即為RT-PCR檢測。目前，PCR技術(shù)發(fā)展已日趨完善，像實時熒光PCR、套式、多重、降落PCR已逐漸成為實驗室常規(guī)檢測手段。2.2 核酸雜交

核酸雜交技術(shù)是較早的應(yīng)用于病原微生物的檢測技術(shù)，首先從樣品中提取核酸（DNA或RNA），將此核酸進(jìn)行變性處理后固定在固相載體上，加入帶有特殊標(biāo)記物的探針，利用堿基互補(bǔ)原理結(jié)合并固定探針，借助探針上標(biāo)記的物質(zhì)可以了解到是否有探針，甚至有多少探針被固定上去，再由此推知樣品中是否含有、甚至含有多少病原微生物。根據(jù)雜交核酸的不同，又可分為Southern印跡法(檢測DNA)及Northern印跡法(檢測RNA)。此外，斑點(diǎn)和原位雜交也是常用病原檢測技術(shù)。2.3 基因芯片

基因芯片技術(shù)在分子病原檢測領(lǐng)域顯示出了強(qiáng)大的生命力，主要是因為它具有微型化、集約化、標(biāo)準(zhǔn)化高通量的的特點(diǎn)。它的基本原理是將大量相似病原的基因保守片段的寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品或其PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量，特別適合數(shù)量較多的樣品的鑒別診斷，在規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)中非常具有應(yīng)用前景。2.3 序列測定

序列測定耗時較長，但是比其它方法更為可靠，是確診的依據(jù)。測序分為全序列測定和保守區(qū)域的測定，全序列測定主要是一些核酸序列較短的病毒，但有時為了對病原進(jìn)行序列分析，有的細(xì)菌、支原體、衣原體等也進(jìn)行全序列測定，但耗費(fèi)巨大。3 血清學(xué)診斷

機(jī)體受致病病感染后，其免疫系統(tǒng)被刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生特異性抗體，用已知的特異性抗原檢測患者體液中有無相應(yīng)特異抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。一般采取動物的血清進(jìn)行試驗，故稱為血清學(xué)診斷。

3.1 ELISA 又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗，是最常用的血清學(xué)診斷方法。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記，結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用于病原檢驗的ELISA主要有:雙抗體夾心法測抗原、雙抗原夾心法測抗體、間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體和ABS-ELISA法。3.2 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

補(bǔ)體結(jié)合試驗是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與病原及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，而補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對應(yīng)。該方法雖操作復(fù)雜但敏感性高、特異性強(qiáng)，能測出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍也較廣。3.3 間接免疫熒光

間接免疫熒光的原理與簡接ELISA的原理相似，只是用熒光素替代酶標(biāo)記抗體，主要是用來檢測組織中的病原。首先將組織制成切片，加入能與待檢病原進(jìn)行反應(yīng)的特異一抗，再加入熒光二抗，通過熒光顯微鏡就可以觀察病原感染情況。以前制約免疫熒光方法使用的環(huán)節(jié)是熒光顯微鏡的數(shù)量太少，但隨著熒光技術(shù)的發(fā)展，熒光顯微鏡已成為實驗室里不可缺少的儀器。3.4 免疫膠體金

免疫膠體金技術(shù)是近年來發(fā)展最快的一種血清學(xué)診斷技術(shù)，它具有其它檢測技術(shù)所無法比擬的簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染的優(yōu)點(diǎn)，具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。膠體金是由氯金酸在還原劑的作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。最常用的免疫膠體金主要有免疫膠體金光鏡染色法，斑點(diǎn)免疫金滲濾法，膠體金免疫層析法。以上方法是動物病原微生物目前最常用的檢測方法，每種待檢樣品都要根據(jù)其疑似病原的特性選擇不同的方法，且大多數(shù)病原需要兩種甚至兩種以上的方法才可以確診，這需要在實際應(yīng)用中靈活選擇。