血清γ-球蛋白的分離純化
一、目的與要求
1、掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理和基本過(guò)程。
2、熟悉鹽析、離心、層析、電泳等生化基本技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的綜合應(yīng)用。
3、學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)和制定分離純化蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方案，技術(shù)路線，質(zhì)量監(jiān)控和保證措施。
二、實(shí)驗(yàn)原理
血清蛋白有300多種，可粗略的分為清、球蛋白兩大類，γ球蛋白只是球蛋白中的一個(gè)亞類。欲用常規(guī)方法獲得，可先用半飽和硫酸銨從血清中鹽析出球蛋白，接著用葡萄糖凝膠G-25脫去球蛋白中的鹽分最后用DEAE纖維素陰離子交換柱便可直接從脫鹽的球蛋白溶液中分離純化出γ球蛋白,其反應(yīng)機(jī)理如下：
C2H5
H
纖維素-O-(CH2)2-N(C2H5)2
纖維素-O-(CH2)2-N+……H2PO4
H++H2PO4
DEAE纖維素離子交換柱
COOH
C2H5
α、β、γ球蛋白
NH2
COO
H
經(jīng)過(guò)鹽析和脫鹽的球蛋白液
纖維素-O-(CH2)2-N+…α和β
G
PH6.3
NH2
交換到柱上的α和β-球蛋白
H2PO4
COOH
γ-球蛋白
NH3+
被DEAE柱分離純化的γ-球蛋白
被柱層析交換結(jié)合的α球蛋白和β球蛋白，可通過(guò)增加洗脫液的離子強(qiáng)度或降低洗脫的pH值（也可兩者同時(shí)改變），使其分部洗脫下來(lái)而被純化。純化前后的γ球蛋白可用電泳方法進(jìn)行比較鑒定。
三、儀器和材料
儀器：離心機(jī)，1.5×40cm層析柱，層析架或滴定臺(tái)，核酸-蛋白檢測(cè)儀，部分收集器，紫外分光光度計(jì)，色譜柱，電泳槽，電泳儀。
材料：馬血清，Sephadex
G-25×200g，DEAE-32×200g。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）分離純化步驟
1、取3mL,4℃預(yù)冷血清，加入3mL
4℃預(yù)冷的飽和硫酸銨。邊滴邊搖。
2、靜置大于10min后，3500rpm離心15min，棄去上清液，將沉淀溶于少量的生理鹽水。從中取0.5mL用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
3、將剩余的樣品上Sephadex
G-25柱，用0.02
mol/L
pH6.5的NH4AC緩沖液洗脫，每管收集3
mL，用于繪制洗脫曲線，選擇顏色最深（即濃度最高管）的取0.5mL留待電泳用。
4、將剩余的蛋白質(zhì)溶液上已平衡好的DEAE-32柱（裝一半的柱子），用0.02
mol/L
pH6.5
NH4AC緩沖液洗脫，用干凈的試管收集，并用20%磺基水楊酸檢測(cè)是否有蛋白流出，并繪制洗脫曲線，收集的蛋白質(zhì)溶液即為γ球蛋白（留少量電泳用，0.5ml測(cè)[Pr]）。
5、柱子再生。先用0.3mol/L高鹽緩沖液，再用0.02mol/L緩沖液平衡。
（二）電泳步驟
1、安裝垂直板電泳槽，按表配制分離膠溶液。用滴管吸取分離膠溶液，沿管壁注入玻璃板至距上端3cm處(插梳為準(zhǔn))
2、立即用滴管沿凝膠管壁加人蒸餾水約0.5cm高度，加水時(shí)應(yīng)注意減少膠液表面的震動(dòng)與擴(kuò)散。加蒸餾水的目的，隔離空氣中的氧和消除凝膠柱表面的彎月面，使凝膠表面平坦（加水時(shí)切勿呈滴狀滴入膠液）。
3、靜置30分鐘，在凝膠表面與水之間出現(xiàn)清晰的界面，表示聚合已完成（注：剛加水時(shí)看出有界面，后逐漸消失，等再看出清晰界面時(shí)，表明凝膠已聚合）。用滴管吸去凝膠管的水層，并用濾紙條（無(wú)毛邊）輕輕吸去凝膠表面殘留的水分，注意不要損傷已聚合的凝膠表面。
4、按表制備濃縮膠，沿管壁加入濃縮膠，插上梳子，靜置15分鐘，待凝膠聚合后，待用。
5、加入10倍稀釋的甘氨酸一Tris緩沖溶液于電泳槽中，用注射針排除樣品孔中的氣泡，樣品與樣品處理液1：1混合后，用微量注射器上樣。
6、將上電泳槽的電極接至電泳儀的負(fù)極，下電泳槽的電極接至電泳儀的正極，接通電源，剛開(kāi)始5分鐘內(nèi)6-7
mA／板，待示蹤染料遷移到下口約0.5cm處時(shí)，就可停止電泳，切斷電源（電泳時(shí)間約為
2／小時(shí)左右）。
7、剝膠
取下玻璃板，用帶有10cm長(zhǎng)的注射針頭，內(nèi)盛蒸餾水作潤(rùn)滑劑。將針頭插人膠與玻璃板之間，邊注水邊慢慢推針前進(jìn)，靠水流壓力和潤(rùn)滑作用使玻璃板與凝膠分開(kāi)。
8、固定，染色與脫色
固定染色液染色過(guò)夜，用脫色液脫色.9、染色，加入染色液，染色過(guò)夜。
10、拍照，記錄結(jié)果。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
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血清樣由于蛋白質(zhì)種類較多，區(qū)帶不清。脫鹽后，樣品中剩余蛋白質(zhì)為α、β、γ-球蛋白，從結(jié)果中可以看到幾條較為明顯的區(qū)帶。γ-球蛋白的電泳結(jié)果顯示其分離的較為純凈。
六、注意事項(xiàng)
1、上樣前要將使用過(guò)的柱子重生。
2、上樣時(shí)要注意3個(gè)相切：緩沖液與柱床表面相切；樣品與柱床表面相切；洗樣時(shí)緩
沖液與柱床表面相切。
3、用瓊脂糖封膠時(shí)一定要封延時(shí)，防止漏膠。
4、配膠時(shí)要按照順序加樣，配完后要立刻混勻。
5、剝膠時(shí)要在水沖洗的情況下進(jìn)行。
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