第一篇：流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用

摘 要：隨著現(xiàn)代激光技術(shù)、電子檢測技術(shù)和電子計算機技術(shù)等的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞儀(FCM)在免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗等領(lǐng)域中得到了更加廣泛的應(yīng)用。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，F(xiàn)CM以快速、靈活及定量等特點被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療的各個方面，尤其是與單克隆抗體技術(shù)的結(jié)合，使其在免疫分型、分選、免疫監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面發(fā)揮了重要的作用，成為現(xiàn)代免疫學(xué)研究不可缺少的工具。該文對近年來流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用進展進行了綜述。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；免疫學(xué)；檢測

流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器[1]。FCM 可對細(xì)胞大小、細(xì)胞表面抗原的表達(dá)等進行快速、靈活、定量、多參數(shù)的檢測，而且，可同時用于檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸定量、DNA倍體、細(xì)胞周期分析，細(xì)胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精確度高、重復(fù)性好和費用低廉等優(yōu)點。流式細(xì)胞儀介紹

1.1 流式細(xì)胞儀的工作原理

流式細(xì)胞儀主要由流動室和液流系統(tǒng)，激光源和光學(xué)系統(tǒng)，光電管和檢測系統(tǒng)，計算機分析系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng)5部分組成，其中，流動室是儀器的核心部件。

將待測標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，由氣壓裝置送入流動室，以一定的流速經(jīng)過噴嘴進入激光聚焦區(qū)，流速的選擇與檢測的目的有關(guān)，此時，在激光束的照射下，被熒光染色的細(xì)胞產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，其散射光信號和熒光信號經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)收集，由檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，各種信號經(jīng)計算機采集后，用相應(yīng)的應(yīng)用軟件進行分析處理，最后，以直方圖或三維圖的形式顯示出來。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可同時測定一個細(xì)胞上的多種不同的特征參數(shù)，從而可以對細(xì)胞進行分類[3]。1.2 流式細(xì)胞儀機型介紹

近年，流式細(xì)胞儀的主要生產(chǎn)廠家有美國的BD(BectonDickinson)公司、貝克曼庫耳(Beckman Coulter)公司和德國的Partec公司。國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由前兩家生產(chǎn)。它們生產(chǎn)出一系列科研型和臨床型的流式細(xì)胞儀，并研制生產(chǎn)了流式細(xì)胞儀所用的各種單克隆抗體和熒光試劑。

流式細(xì)胞儀可分為兩大類，一類為臨床分析型(又稱小型機、臺式機)，其特點為儀器光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，易學(xué)易掌握，適合在臨床實驗室中應(yīng)用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。

另一類為科研分選型(又稱綜合型)，特點為功能齊全，分析靈活，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來，同時可選配多種波長類型的激光器，適用于廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。

隨著計算機技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的制造工藝、功能、精確度等有了質(zhì)的飛躍。流式細(xì)胞儀已開始向模塊化發(fā)展，即它的光學(xué)系統(tǒng)、檢測器單元和電子系統(tǒng)都可以按照試驗要求隨意更換[4]。各流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠商繼續(xù)推出新產(chǎn)品以滿足用戶的不同需要。如BD公司的FACSAria(高速細(xì)胞分選儀)、分選增強型FACSVantage SETM(多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀)、LSR II(數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀)，F(xiàn)ACSCanto(雙激光六色分析流式細(xì)胞儀)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics ?FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用單激光或雙激光激發(fā)方式，可進行五色分析。Partec公司的頂級科研型十三色熒光流式細(xì)胞儀CYFLOW ML，臨床科研型六色熒光流式細(xì)胞儀DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流動成像細(xì)胞儀)，將流式多色檢測技術(shù)和熒光顯微圖像顯示技術(shù)結(jié)合在一個平臺上，不僅可以通過熒光信號的強度，還可以通過細(xì)胞熒光圖像對細(xì)胞內(nèi)外信號定位，從而對細(xì)胞亞群進行定性和定量分析。流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和免疫學(xué)研究的深入，流式細(xì)胞儀在分子免疫學(xué)、免疫生物學(xué)和免疫遺傳學(xué)，免疫血液學(xué)、免疫藥理學(xué)、移植免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、抗感染免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)等免疫學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科，以及淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞因子檢測等臨床研究中，也有了越來越廣泛的應(yīng)用。

2.1 淋巴細(xì)胞及其亞群分析

FCM在臨床淋巴細(xì)胞及其亞群分析中得到廣泛應(yīng)用，可同時檢測出一種或幾種淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面抗原，將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，并計算出它們相互間的比例。通過淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量的檢測，可了解在不同情況下機體的免疫功能狀態(tài)，輔助臨床疾病的診斷，探索疾病的發(fā)病機理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案[5]。

由于FCM可以進行高靈敏度、高速度和多參數(shù)分析，使FCM對血液淋巴細(xì)胞亞群的檢測較其他方法更精確，故其被認(rèn)為是血液淋巴細(xì)胞亞群分析的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]。

2.1.1 檢測項目 在臨床上，淋巴細(xì)胞及其亞群分析項目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；絕對計數(shù)(TruCount)；活化淋巴細(xì)胞的檢測(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和CD8＋Ts/c的進一步區(qū)分；Naive/Memory T細(xì)胞亞群的檢測；Th1/Th2亞群的檢測。

用流式細(xì)胞儀診斷某種疾病時，經(jīng)常需要檢測多個項目，如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機體免疫功能下降。檢測的免疫指標(biāo)表現(xiàn)為：T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少(正常值的65%～81%)；T細(xì)胞亞群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th細(xì)胞(CD4＋)絕對計數(shù)<200個/μL(正常值400～1 500細(xì)胞/μL)，CD8＋ T細(xì)胞在感染早期增多，后期則下降；Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；CD4＋/CD8＋ 明顯低于健康成人(P<0.01)。

2.1.2 檢測技術(shù)的發(fā)展 隨著新的熒光色素分子的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記技術(shù)的進步和流式細(xì)胞儀的多激光激發(fā)技術(shù)的進展，多色熒光分析得到迅速發(fā)展，三色、四色甚至五色或六色熒光分析對細(xì)胞亞群的識別、細(xì)胞功能評價等更為精確。近年，淋巴細(xì)胞及其亞群的分析已經(jīng)發(fā)展到三色熒光以上分析，且借用MultiSET全自動獲取分析軟件完成。如：通過四色熒光標(biāo)記，對外周血T淋巴細(xì)胞亞群可進行快速、客觀、準(zhǔn)確檢測及絕對計數(shù)分析[78]。利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T 細(xì)胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，從而對LFA1adhesive T 細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測定[9]。

總之，用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞及其亞群的檢測技術(shù)朝著多激光、多色分析方向發(fā)展。近年來，為了使樣本一次檢測，得到更多結(jié)果，滿足臨床多色分析診斷的需要，一些廠家為臨床應(yīng)用專門設(shè)計了六色分析流式細(xì)胞儀。

2.2 白血病免疫分型

白血病是白細(xì)胞在分化到某個階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以對白血病進行免疫分型，對其進行導(dǎo)向治療[10]。近年，白血病的MICM(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)，分子生物學(xué))分型已成為現(xiàn)代白血病診斷的重要指標(biāo)，其中應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行免疫表型的檢測在分型中發(fā)揮了越來越重要的作用，現(xiàn)已積累了豐富的應(yīng)用經(jīng)驗。它具有快速、客觀、準(zhǔn)確、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，對白血病進行免疫分型具有極其重要的臨床診斷意義[11]。

準(zhǔn)確的免疫分型關(guān)鍵是區(qū)分正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀白血病免疫分型依賴于白血病細(xì)胞的FSC/SSC特性來設(shè)定原始細(xì)胞群，然后根據(jù)門內(nèi)某些陽性單抗占門內(nèi)細(xì)胞的百分比來確定其抗原表達(dá)情況。很顯然，這種方法是不能將原始細(xì)胞與正常細(xì)胞完全分開的。

隨著免疫學(xué)和遺傳學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)的發(fā)展，由開始的主要采用間接免疫熒光標(biāo)記法到直接免疫熒光標(biāo)記法，從單色或雙色到利用CD45抗體標(biāo)記設(shè)門法進行多色免疫標(biāo)記。利用造血系統(tǒng)細(xì)胞CD45表達(dá)量與細(xì)胞分化程度的高度相關(guān)性，可以精確地將原始/幼稚細(xì)胞與正常成熟細(xì)胞群完全分開。使免疫分型的準(zhǔn)確性得到很大的提高，現(xiàn)在，已成為診斷白血病免疫分型的重要工具[12]。國際上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC設(shè)門法，并結(jié)合其他技術(shù)進行免疫分型。如應(yīng)用流式細(xì)胞儀，采用CD45 SSC 設(shè)門法多參數(shù)，并利用抗體積分系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確地、完整地分析白血病免疫分型[13]。采用三色流式細(xì)胞術(shù)CD45/側(cè)散射(SSC)雙參數(shù)散點圖設(shè)門，并結(jié)合FAB 形態(tài)學(xué)能對急性白血病進行準(zhǔn)確分型[14]。應(yīng)用流式細(xì)胞儀四色熒光標(biāo)記技術(shù)，CD45/SSC雙參數(shù)散點圖設(shè)門方法，能清楚地區(qū)分各種免疫細(xì)胞，可準(zhǔn)確、客觀地進行白血病免疫分型[15]。

2.3 血小板膜表面受體檢測

血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測血小板膜上受體，主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標(biāo)志物進行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)合單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)，用不同的抗血小板單克隆抗體，可以從分子水平上診斷血小板功能和數(shù)量的異常。使用流式細(xì)胞儀測定活化血小板是目前公認(rèn)的快捷而靈敏的方法之一[16]，可直接、靈敏、特異地分析血小板的活化程度和功能狀態(tài)。

普遍采用的技術(shù)是以全血為標(biāo)本，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行多參數(shù)分析，即全血法流式細(xì)胞術(shù)。如采用流式細(xì)胞儀三色熒光標(biāo)記技術(shù)，能準(zhǔn)確地檢測冠心病患者血小板表面糖蛋白的變化[17]。采用流式細(xì)胞儀和三色免疫熒光標(biāo)記的單克隆抗體，可直接檢測全血樣本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表達(dá)水平[18]。

與常規(guī)血小板功能測定法相比，全血法流式細(xì)胞術(shù)雖然有許多優(yōu)點，如直接使用全血樣本，且標(biāo)本用量少；簡化標(biāo)本的處理，避免了樣本處理不當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致的血小板體外激活，并可防止血小板亞群的丟失，從而更客觀、更準(zhǔn)確地反映血小板的功能[19]。但是，全血法流式細(xì)胞術(shù)也存在不足之處，如流式細(xì)胞儀價格昂貴，為了避免血小板體外活化，血樣不能久置，需在45 min內(nèi)處理；只能分析循環(huán)中的血小板的數(shù)量和功能，不能反映血小板代謝和最近被清除的血小板的數(shù)量。所以，還需對該方法進行更深入的研究，并使之標(biāo)準(zhǔn)化[20]。

2.4 細(xì)胞因子的檢測 細(xì)胞因子(cytokine)是由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽，在調(diào)節(jié)機體多種細(xì)胞的生長、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。檢測細(xì)胞因子對于闡明機體免疫應(yīng)答機制及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和臨床治療具有重要意義。

隨著研究的進展，僅僅對細(xì)胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。目前，越來越重視在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接免疫熒光法，可在單細(xì)胞水平上客觀、正確地檢測細(xì)胞內(nèi)多個細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群，進行多參數(shù)相關(guān)分析，是一種有效地在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的方法[21]。

近年主要采用的是胞內(nèi)流式分析法。該方法是基于BD公司的快速免疫細(xì)胞因子系統(tǒng)(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)加離子霉素(ionomycin，Ion)作刺激劑，刺激全血中淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)與莫能霉素(monensin，MN)等藥物阻斷細(xì)胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8設(shè)門，應(yīng)用兩種免疫熒光抗體同時標(biāo)記淋巴細(xì)胞膜表面特異分子和被阻滯在胞內(nèi)的細(xì)胞因子，然后用流式細(xì)胞儀進行檢測和分析。

該方法具有許多優(yōu)點，如完善的全血激活方法，保留體內(nèi)細(xì)胞及生化微環(huán)境，能更準(zhǔn)確反映體內(nèi)狀況，避免了人工假象的產(chǎn)生。高效熒光結(jié)合抗體，確保高度靈敏及低背景染色。高質(zhì)量的膜通透劑，可以保證一致的靈敏度與低背景染色，且免除了為增加通透性所需冷凍細(xì)胞過夜的步驟。同型對照，避免了使用重組細(xì)胞因子進行繁瑣的競爭性封閉。

該技術(shù)雖然已成為一項可在單細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞因子的有效方法，尤其是在確定功能不同的T細(xì)胞亞群方面具有重要的作用[22]，具有其他方法難以比擬的優(yōu)點。但是，也存在一定的缺陷，如現(xiàn)有的激活劑可導(dǎo)致部分至表面分子表達(dá)的下調(diào)。因此，今后還要尋找更佳的激活劑。結(jié)語

FCM以其快速、準(zhǔn)確、靈活、大量、多參數(shù)同時分析等優(yōu)點，已成為免疫學(xué)研究領(lǐng)域中無可替代的重要工具?？萍妓降牟粩喟l(fā)展，免疫學(xué)研究的不斷深入，尤其是近年來，流式細(xì)胞儀的功能不斷完善、各種功能強大的分析軟件的開發(fā)、多參數(shù)分析技術(shù)的發(fā)展等，為流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的提高和分析能力的擴展提供了保障，并使儀器不斷向小型化，操作自動化，簡單化方向發(fā)展?？梢灶A(yù)見，在未來免疫學(xué)領(lǐng)域，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍會進一步擴大，應(yīng)用深度會進一步加強。

第二篇：模塊教學(xué)在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用

模塊教學(xué)在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用

模塊教學(xué)的內(nèi)容模塊教學(xué)是將醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的全部課程根據(jù)各章節(jié)的知識特點、學(xué)習(xí)要求、臨床結(jié)合度、基礎(chǔ)性等不同劃分為幾個模塊,各模塊根據(jù)其自身內(nèi)容和特點選擇相應(yīng)的教學(xué)方式,避免了醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課程的枯燥乏味,也保證了學(xué)生對醫(yī)學(xué)免疫學(xué)基礎(chǔ)理論的掌握和理解,同時又能兼顧臨床知識的聯(lián)系和科研意識的培養(yǎng)。這種教學(xué)內(nèi)容的劃分也避免了對醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)體系的完全變革,因此能適應(yīng)新形勢下對醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課程教學(xué)的新要求。

1.1 基礎(chǔ)知識模塊 包括緒論、免疫器官和組織、免疫細(xì)胞、抗原、抗體、補體、MHC、免疫應(yīng)答等章節(jié)。這些章節(jié)的教學(xué)內(nèi)容中包括大量免疫學(xué)基本概念和基本原理,特點是基礎(chǔ)性很強,這一模塊的教學(xué)內(nèi)容無論如何變革,都必須保證學(xué)生的理解和掌握。最好的方法就是保持其基礎(chǔ)性,按照傳統(tǒng)教學(xué)法進行教學(xué),也可結(jié)合啟發(fā)式教學(xué),保證學(xué)生能順利掌握基礎(chǔ)內(nèi)容?？蓪⒅R點劃分為“掌握”、“熟悉”和“了解”內(nèi)容,讓學(xué)生知道哪些是必須掌握的,哪些是需要理解的,也可根據(jù)知識點整理針對每一章的自測試題,完成課堂教學(xué)內(nèi)容后,布置學(xué)生自測,強化教學(xué)效果。教師可通過自測題的完成情況來了解學(xué)生對此模塊教學(xué)內(nèi)容的學(xué)習(xí)情況, 保證學(xué)生對基礎(chǔ)理論知識的真正掌握。

1.2 前沿進展模塊 包括細(xì)胞因子、分化抗原、黏附分子、免疫耐受、免疫調(diào)節(jié)、免疫診斷、免疫治療等章節(jié)。這一模塊的特點是教學(xué)內(nèi)容需掌握的知識點較少,但范圍較廣,而且涉及免疫學(xué)研究前沿內(nèi)容較多。如果仍采用傳統(tǒng)教學(xué)形式, 難免枯燥乏味,不易理解。因此這一模塊的教學(xué)可以適當(dāng)與科研相結(jié)合,將免疫學(xué)前沿內(nèi)容融入到教學(xué)中,相關(guān)綜述文獻(xiàn)的查找、閱讀、討論、寫作嘗試等方法均可以在此模塊中應(yīng)用。學(xué)生通過閱讀文獻(xiàn)或親自撰寫綜述文獻(xiàn),可以近距離接觸免疫前沿知識和相關(guān)內(nèi)容的科研進展,順利完成此模塊教學(xué)內(nèi)容的同時,可以培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣和查找閱讀文獻(xiàn)的能力。此模塊可以通過學(xué)生參與的認(rèn)真程度、撰寫綜述的符合標(biāo)準(zhǔn)程度、對所查文獻(xiàn)的理解程度、對相關(guān)章節(jié)的了解程度等評價學(xué)生的學(xué)習(xí)效果。1.3 臨床免疫學(xué)模塊 包括自身免疫病、免疫缺陷病、移植免疫、腫瘤免疫等章節(jié)。此模塊主要涉及免疫系統(tǒng)在病理狀態(tài)下功能的改變以及異常免疫應(yīng)答在發(fā)病機制中的作用,與臨床關(guān)系非常密切,此部分也是多數(shù)學(xué)生學(xué)習(xí)和關(guān)注的重要部分,學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣較高。但是這些章節(jié)并不作為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)的重點,學(xué)時通常占用較少,根本無法系統(tǒng)學(xué)習(xí)和認(rèn)識免疫與相關(guān)疾病的關(guān)系,而這些疾病往往又屬于臨床常見病和多發(fā)病,因此傳統(tǒng)教學(xué)無法滿足學(xué)生對臨床疾病 熟悉和了解的需要。在此模塊教學(xué)中應(yīng)以疾病為線索,引導(dǎo)學(xué)生將剛剛學(xué)習(xí)過的免疫學(xué)基礎(chǔ)知識應(yīng)用于臨床疾病的發(fā)病機制、診斷原理、預(yù)防和治療原理之中。教學(xué)中可以使用 PBL教學(xué)法或病例分析教學(xué)法,通過教師提出問題或?qū)W生自己提問、自己回答的方式,系統(tǒng)、全面、深入、自主的掌握這一部分內(nèi)容,也可以直接應(yīng)用病例要求學(xué)生進行深入討論。無論哪一種方式,都可以很好地使醫(yī)學(xué)免疫學(xué)基礎(chǔ)知識與臨床常見病相結(jié)合,從而培養(yǎng)學(xué)生分析疾病發(fā)生機制、檢測、診斷和治療原理的能力。此部分內(nèi)容可以通過學(xué)生書寫報告或者上交討論記錄等形式進行考評。

1.4 知識應(yīng)用模塊 包括超敏反應(yīng)、免疫預(yù)防等章節(jié),此模塊教學(xué)內(nèi)容與現(xiàn)實生活、免疫相關(guān)疾病的預(yù)防密切相關(guān),如過敏癥的發(fā)生、疫苗的使用方法和原理等,特別是近年來一些流行病的爆發(fā),其預(yù)防和治療方法都是學(xué)生較為關(guān)心的內(nèi)容。此部分的教學(xué)應(yīng)選用較為靈活的教學(xué)方法,可以根據(jù)不同主講教師的特點和能力,也可以根據(jù)不同專業(yè)的特點進行多種教學(xué)方法的聯(lián)合應(yīng)用。教學(xué)方法中應(yīng)以討論式教學(xué)或論壇式教學(xué)為主,也可以結(jié)合演講、小品、錄像等多種形式鼓勵學(xué)生積極參與,在愉快的教學(xué)活動中學(xué)習(xí)到更多、更實用的知識。此部分可根據(jù)氣氛的熱烈程度、分析的深入程度、總結(jié)結(jié)論的準(zhǔn)確程度等對學(xué)生進行評價。2 模塊教學(xué)的評價模塊教學(xué)法的優(yōu)點是伸縮性較強,可以逐步實施。教師從傳統(tǒng)教學(xué)模式向其他教學(xué)模式的轉(zhuǎn)變需要過程,包括思維轉(zhuǎn)變的過程、教學(xué)能力提高的過程、新教學(xué)法的適應(yīng)過程等。模塊教學(xué)應(yīng)用過程中可以采取逐步增加的方式,根據(jù)不同教師能力和個性特點,有選擇性的增加模塊。比如年輕教師能力不夠,可以在基礎(chǔ)知識模塊上增加知識應(yīng)用模塊,適應(yīng)和駕馭后再增加臨床知識模塊,之后增加前沿進展模塊;科研能力較強的教師可以先增加前言進展模塊;對PBL和案例分析感興趣的教師也可以先增加臨床知識模塊。這種方式可以更好的發(fā)掘教師的潛力和熱情,避免因全面改革使用新的教學(xué)方法,導(dǎo)致的教師和學(xué)生不適應(yīng)和抵觸情緒,達(dá)不到真正想要的教學(xué)效果。

第三篇：免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用

楊明

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

食品安全問題在21世紀(jì)的今天已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重大問題，對國家的經(jīng)濟發(fā)展和消費者的身體健康產(chǎn)生了重大影響。隨著我國市場經(jīng)濟的的不斷完善和發(fā)展，食品行業(yè)對外貿(mào)易與日劇增，食品的質(zhì)量與安全問題已成為影響農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)產(chǎn)品競爭力的關(guān)鍵因素。同時，由于我國人民生活已由溫飽型食物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向營業(yè)健康型食物結(jié)構(gòu)，全民食品營業(yè)衛(wèi)生知識得到普及。人民的飲食消費觀念也由數(shù)量型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型，對食品衛(wèi)生質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求越練越高，這就對食品檢測技術(shù)提出更高的要求。

由于食品種類豐富，食品中檢測的有毒有害物質(zhì)種類和組分繁多，需要檢測的物質(zhì)質(zhì)量極低，樣品中待檢物的濃度常為μg、ng甚至 pg級，除此之外，許多檢測物除需檢測物質(zhì)本身，還涉及其衍生物和降解物測定。區(qū)別同位異構(gòu)體以及元素的價態(tài)等。因此食品檢測要求檢測方法更加準(zhǔn)確、快速、方便，也使得其他學(xué)科的先進技術(shù)不斷應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域中來，由于新技術(shù)的引入，食品行業(yè)開發(fā)出了許多自動化程度和精確度很高的檢測儀器，這不僅縮短了分析時間，減少了人力誤差，也大大提高了食品分析檢測的速度、靈敏度和準(zhǔn)確度?，F(xiàn)代食品檢測技術(shù)主要包括以下幾個方面：①計算機視覺技術(shù)；②現(xiàn)代儀器分析技術(shù)；③食品物性的力學(xué)、聲學(xué)和電學(xué)檢測技術(shù)；④電子傳感檢測技術(shù)；⑤生物傳感技術(shù)；⑥核酸探針檢測技術(shù)；⑦PCR基因擴增技術(shù)；⑧免疫學(xué)檢測技術(shù)。

免疫學(xué)檢測技術(shù)是食品檢測技術(shù)中的一個重要組成部分，特別是三大免疫技術(shù)——熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)在食品檢測中得到了廣泛應(yīng)用。利用免疫學(xué)檢測技術(shù)可檢測細(xì)菌、病毒、真菌、各種毒素、寄生蟲等，還可用于蛋白質(zhì)、激素、其他生理活性物質(zhì)、藥物殘留、抗生素等的檢測，其檢測方法簡便、快速、靈敏度高、特異性強，特別是單克隆抗體的發(fā)展，使得免疫檢測方法特異性更強，結(jié)果更準(zhǔn)確。

免疫分析是抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。1959年，Yalow和Berson 將發(fā)射性同位素示蹤與免疫反應(yīng)相結(jié)合建立了發(fā)射免疫測定法，從而開創(chuàng)了免疫分析這一嶄新領(lǐng)域，次后又發(fā)展了許多替代或非同位素免疫免疫分析法。

1．免疫熒光技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

免疫熒光分析（Immuno Fluorescence Assay , IFA）始創(chuàng)于20世紀(jì)40年代初，1942年Cons等首次報道用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗體，但此種熒光素標(biāo)記物的性能較差，未能推廣應(yīng)用，20世紀(jì)50年代，Riggs等合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光素。Mashall等對熒光抗體的標(biāo)記方法又進行了改進，從而使得免疫熒光技術(shù)逐漸推廣應(yīng)用。1．1 基本原理

抗體與熒光素結(jié)合后，并不影響其與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，事先將待測抗原固定與玻璃載玻片上，滴加熒光標(biāo)記抗體，若熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，不能被緩沖液沖掉，載熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩沖液沖掉，在顯微鏡下觀察不到熒光。1．2 熒光免疫測定法的分類

根據(jù)標(biāo)記熒光產(chǎn)生的方式不同分為底物標(biāo)記熒光測定法、熒光偏振免疫測定法、熒光猝滅增強免疫測定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA應(yīng)用較多。

1．2．1 底物標(biāo)記熒光測定法

底物標(biāo)記熒光測定法（SLFIA）使用一種酶的底物標(biāo)記待測物，底物本身無熒光，在受到相應(yīng)酶的催化時能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕?，?dāng)標(biāo)記底物與抗體結(jié)合產(chǎn)生的空間位阻阻礙了酶與標(biāo)記底物間的接觸，樣品中的待測物通過競爭作用使游離的酶標(biāo)結(jié)合物或熒光強度增加。1．2．2熒光偏振免疫測定法

使用偏振光作為激發(fā)光時，視分子的運動狀態(tài)，發(fā)射的熒光可能是振動方向各向隨機化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光（ploarized fluorescence）在反應(yīng)液中，游離的標(biāo)記物分子體積小，在布朗運動中轉(zhuǎn)動速度快，受偏振光照射后產(chǎn)生的熒光偏振方向被分散，不能產(chǎn)生偏振光，只發(fā)射普通熒光；與抗體結(jié)合的標(biāo)記物分子體積增大，布朗運動速度減慢，甚至不能轉(zhuǎn)動而形成定向排列，所以受偏振光激發(fā)后能產(chǎn)生偏振熒光，樣品中的待測物的量越大，偏振熒光的強度越高。

1．2．3 熒光淬滅免疫測定法

熒光淬滅免疫測定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是當(dāng)熒光標(biāo)記物與抗體結(jié)合后發(fā)生熒光淬滅。熒光猝滅的機制尚不清楚，熒光淬滅可能與標(biāo)記物與抗體結(jié)合后導(dǎo)致電子振動狀態(tài)的改變有關(guān)。1．2．4熒光增強免疫測定法

熒光增強免疫測定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理與熒光淬滅增強免疫測定法相似，不同的是標(biāo)記物與抗體結(jié)合后熒光強度增強。酶免疫檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

酶免疫檢測技術(shù)是在20世紀(jì)60年代在熒光和組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，最初用酶代表熒光素標(biāo)記抗體作為生物組織中抗原的鑒定和定位。隨后發(fā)展為用于鑒定免疫擴散及免疫電泳板上的沉淀線，到1971年，Engrall等用堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），這一技術(shù)因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、應(yīng)用范圍廣、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點，是目前食品檢測中令人矚目的有發(fā)展前途的一種新技術(shù)。2．1 酶免疫技術(shù)的基本原理

用酶標(biāo)記已知的抗原（抗體），然后與樣品在一定條件下反應(yīng)，如果樣品中含有相應(yīng)的抗體（抗原），抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以定性定量測定樣品中的抗體（抗原）。2．2 酶免疫技術(shù)的分類

酶免疫技術(shù)發(fā)展迅猛，種類繁多，酶免疫技術(shù)分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測定技術(shù)，酶免疫測定技術(shù)又分為均相免疫測定和異相免疫測定技術(shù)，異相免疫測定技術(shù)又分為固相免疫測定技術(shù)和液相免疫測定技術(shù)。2．3 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù) 2．3．1 基本原理

抗體（抗原）與酶結(jié)合后，仍然能和相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合，將待測樣品事先包被于固相載體表面，加入酶標(biāo)抗體（抗原），酶將抗體（抗原）于吸附于固相載體上相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，不能被緩沖液沖掉，當(dāng)加入酶的底物時，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，呈顏色變化，顏色深淺與待測抗原或抗體的量有關(guān)，可定性或定量測定抗原或抗體。ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法。2．3．2 ELISA技術(shù)在食品安全性檢測中的應(yīng)用及前景

ELISA技術(shù)把抗原抗體特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)合，使食品在未經(jīng)分離的提取的情況下，即可進行定性和定量分析。近年來，該技術(shù)在食品安全檢測中正逐步推廣應(yīng)用，用于細(xì)菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生蟲的檢測。還用于蛋白質(zhì)、激素、農(nóng)業(yè)殘留、獸藥殘留和抗生素及食品成分和劣質(zhì)食品的檢測分析。ELISA技術(shù)由于靈敏度高、特異性強、檢測費用低和易于商品化，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

3．放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

放射免疫技術(shù)（Radio Immunoassay ,RIA）是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測靈敏性，本法靈敏度高，測定準(zhǔn)確性良好，特別適應(yīng)于蛋白質(zhì)、激素和多肽的精確定量測定。3．1 基本原理

放射免疫分析的基本原理是標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異性抗體的競爭結(jié)合反應(yīng)。在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的，抗體量一般采用能結(jié)合40％-50%的標(biāo)記抗原，而受檢標(biāo)本中的非標(biāo)記抗原是變化的，根據(jù)標(biāo)本中抗原的量不同，得到不同的反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)標(biāo)記抗原、非標(biāo)記抗原和特異性抗體三者同時在于一個反應(yīng)系統(tǒng)時，由于標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競爭特異性的抗體，由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物形成的量就隨著非標(biāo)記抗原的量而改變。非標(biāo)記抗原量增加，相應(yīng)的結(jié)合較多的抗體，從而抑制了標(biāo)記抗原對抗體的結(jié)合，是標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)的增加，亦即抗原抗體復(fù)合物中的放射性強度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。若將抗原抗體復(fù)合物與游離的標(biāo)記抗原分開，分別測定其放射強度，就可計算出結(jié)合的標(biāo)記抗原（B）與游離的標(biāo)記抗原（F）的比值（B/F），這與標(biāo)本中的抗原呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同的標(biāo)準(zhǔn)抗原進行測定，計算相應(yīng)的B/F值，可得到一條劑量反應(yīng)曲線，受檢標(biāo)本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線是查出標(biāo)本中的抗原含量。放射免疫測定 分為液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。3．2 放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

RIA測定就是應(yīng)用放射性物質(zhì)代替ELISA中的標(biāo)記酶作為抗原或抗體耦聯(lián)物，在食品安全檢測中最常見的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了放射免疫檢測技術(shù)（RRA），放射免疫檢測在快速檢測方面最成功的是CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)就是利用專一受體來識別結(jié)合于同一類抗生素族中的母環(huán)以便最快速同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。目前，CharmⅡ7600檢測系統(tǒng)就β－內(nèi)酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、氨唑西林及堿性磷酸酶這六項檢測以被FDA認(rèn)可。放射免疫技術(shù)由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、果疏產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量的檢測中廣泛應(yīng)用。還可檢測經(jīng)食品傳播的細(xì)菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用放射免疫測定牛奶中的天花粉蛋白。

4．免疫膠體金檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

免疫膠體金檢測技術(shù)又叫Rosa.Tests法，是利用膠體金顆粒進行標(biāo)記的一項新技術(shù)。4．1基本原理

氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等分子被吸附到膠體金顆粒表面的過程，吸附機理可能是膠體金顆粒表面帶有負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而行形成牢固結(jié)合，用已知還原法可以方便地從HAuCl4制備各種不同的粒徑，不同顏色的膠體金顆粒，這種球形的顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共價結(jié)合。

免疫膠體金檢測原理是利用了金顆粒具有電子密度的特性，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點。因而可用于定性或定量的快速檢測方法中。這一方法可通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。4．2 免疫膠體金技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

該技術(shù)當(dāng)前主要用于在牛奶中檢測抗生素，可在十分鐘內(nèi)快速檢測牛奶中的抗生素，利用該技術(shù)可檢測的抗生素種類有六種，β－內(nèi)酰胺、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星和黃曲霉毒素，可檢測的β－內(nèi)酰胺藥物有氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素頭孢噻呋、頭孢霉素和青霉素G等。由于該技術(shù)結(jié)果直觀、操作簡單，在食品安全檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。單克隆抗體技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成，每個B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因，如果能選出一個制造一種專一抗體的細(xì)胞進行培養(yǎng)，就可以得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成的細(xì)胞群，即克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體。1975年，Kohler和 Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合，形成了雜交細(xì)胞即可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng) 立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。5．1 基本原理

B淋巴細(xì)胞具有專一性的合成針對某一抗原決定簇的抗體，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長，而骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞即雜交瘤細(xì)胞，這種雜交瘤細(xì)胞即具有專一性合成某一抗體的特性，也具有瘤細(xì)胞能在體外無限增殖的特性，用這種雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異性單克隆抗體，這種用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體稱為第二抗體，主要抗原能引起小鼠的抗體應(yīng)答，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體。5．2 單克隆抗體技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

單克隆抗體在食品檢測中最大的優(yōu)點是特異性強，不易出現(xiàn)假陽性。在食品檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。目前人們已制備出各種經(jīng)食品傳播和引起食物中毒的細(xì)菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農(nóng)藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法。

磺胺二甲嘧啶和克倫特羅（瘦肉精）這兩種藥物被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點，國內(nèi)研究出了用于動物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的多克隆試劑盒。這兩種試劑盒具有特異性強、儀器化程度低、樣品前處理簡單、檢測時間短，在實際生產(chǎn)中應(yīng)用前景廣闊，填補了國內(nèi)空白。

單克隆抗體檢測技術(shù)可在十分鐘內(nèi)快速檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類、擬除蟲菊酯類及激素類的殘留量為農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)安全提供技術(shù)支持。

英國建立了自動肉制品中的沙門氏菌的單克隆抗體檢測方法，人們還制出了單核增生性李特氏桿菌的單抗，用單抗ELISA檢測該菌。乳中氯霉素的單克隆抗體檢測技術(shù)也被建立。

食品儲藏過程中會受到霉菌污染，現(xiàn)已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成單克隆抗體用ELISA方法可檢出加熱和未加熱食品中的霉菌。免疫測定新技術(shù)

6．1 脂質(zhì)體免疫測定法

脂質(zhì)體免疫測定法（LIA）是一種較新的免疫測定技術(shù)，脂質(zhì)體是由磷脂或由其他類脂分子在水相中自發(fā)形成的一種密閉的雙分子單層或多層囊泡，脂質(zhì)體表面還可以連接抗原或抗體分子。這種生物模擬膜在形成過程中能包裹水及其中的溶質(zhì)（染料或酶），膜的穩(wěn)定性可隨免疫反應(yīng)有規(guī)律變化。根據(jù)釋放出的標(biāo)記物的量進行測定，所以LIA具有很高的信號放大作用。目前LIA主要存在脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和非特異性溶解問題。6．2 克隆酶給予體免疫測定法

克隆酶給予體免疫測定法（CEDIA）是一種新型均相免疫測定法。CEDIA中使用由重組DNA技術(shù)獲得的?半乳糖苷酶兩個獨立的蛋白質(zhì)片段，這兩個片段獨立存在時無酶活性，但兩個片段結(jié)合則顯示催化活性。以此作為分析方法的基礎(chǔ)。其中較小片段稱為酶給予體片段（ED），另一片段稱為酶受體片段（EA）。ED標(biāo)記物與抗體集合后不再與EA形成酶，所以當(dāng)樣品中待測物增 加時則游離ED標(biāo)記物增多，使反應(yīng)液中酶產(chǎn)生增加，經(jīng)底物顯色測定。CEDIA是目前靈敏度較高的均相免疫測定法。6．3 發(fā)光免疫測定法

發(fā)光免疫測定法（CLIA）常用魯米諾（Luminol）、異魯米諾（Isoluminol）及其衍生物進行標(biāo)記。這些環(huán)肼類化合物在堿性條件下可被氧化產(chǎn)生3-胺基苯二甲酸鹽和430nm的發(fā)射光。在魯米諾的芳氨基上進行烴鏈取代后產(chǎn)光性能增強，但若置換芳氨基則發(fā)光被破壞。另外丫叮酯也用于發(fā)光標(biāo)記。CLIA操作簡單、靈敏度高、測定速度快。但CLIA產(chǎn)光物質(zhì)發(fā)光時間極短（數(shù)秒鐘），測定誤差較大。6．4免疫傳感器技術(shù)

免疫傳感器是生物傳感器的一種，近年來已取得迅速發(fā)展。免疫傳感器的探頭主要由兩部分組成；感受器：通常覆有連接有特異性抗體的可更換的傳感膜；換能器：能將抗原抗體產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)換為可供儀器檢測的電信號。免疫傳感器使用對象廣泛，專一性較強，高度的自動化，微型化與集成化減少對使用者及環(huán)境技術(shù)條件的依賴，測定速度快，適合現(xiàn)場或野外操作。6．5 多組分免疫測定法

根據(jù)不同檢測物標(biāo)記方法互不相同，分析條件和檢測信號互不干擾。同一反應(yīng)液中同時檢測不同的檢測物。但這種方法必須使幾種標(biāo)記物的測定條件相互協(xié)調(diào)，其靈敏度和組分?jǐn)?shù)受到限制。

免疫反應(yīng)最大的特點是高度選擇性，抗原抗體的親和數(shù)通常為109或更高。作為一種分析手段，免疫分析技術(shù)操作簡單、速度快、分析成本低，在食品安全檢測中已表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。此外免疫分析技術(shù)能與其他技術(shù)聯(lián)用，在聯(lián)用方法中免疫技術(shù)即可作為高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜法（GC）等測定技術(shù)的樣品進化或分離手段，也可作為其離線或在線檢測方法。這些方法結(jié)合了免疫分析的選擇性，靈敏性與HPLC，GC等技術(shù)的高速，高效分離和準(zhǔn)確檢測能力，使分析過程簡化，分析成本下降，拓展了待測物范圍。

免疫分析測定法提供的待測物組分或結(jié)構(gòu)方面的信息太少，一般不具備多殘留分析能力；免疫分析過程復(fù)雜，影響因素眾多，且不易控制，結(jié)果易于出現(xiàn)假陽性，方法難以標(biāo)準(zhǔn)化；方法建立過程復(fù)雜，研究周期長，某些待測物半抗原難以合成。免疫測定法不可能取代色譜或光譜等常規(guī)分析方法，只能作為其重要補充。

參考文獻(xiàn)

[1]現(xiàn)代食品檢測技術(shù).趙杰文,孫永海主編.中國輕工業(yè)出版社.北京,2005:4.[2]獸藥殘留分析.趙俊鎖,邱月明,王超主編.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.2002:2.[3]食品安全與衛(wèi)生.曹小紅主編.科學(xué)出版社.2006:7.[4]獸醫(yī)免疫學(xué).杜念心主編.中國農(nóng)業(yè)出版社.北京:1997.[5]分子免疫學(xué).余傳霖主編.上海醫(yī)科大學(xué)出版社.復(fù)旦大學(xué)出版社.上海:2001.[6]細(xì)胞和分子免疫學(xué).余伯泉主編.科學(xué)出版社.2001.[7]乳和乳制品檢測技術(shù).翁鴻珍主編.中國輕工業(yè)出版社.北京:2006.[8]乳品安全和乳品檢測技術(shù).龐廣昌,陳慶森,劉志和,等主編.科學(xué)出版社.北京： 2005.

第四篇：免疫學(xué)技術(shù)在生豬屠宰檢疫中的應(yīng)用（范文模版）

免疫學(xué)技術(shù)在生豬屠宰檢疫中的應(yīng)用

[摘 要] 針對我國生豬屠宰檢疫的現(xiàn)狀，論述了免疫學(xué)技術(shù)在提高生豬屠宰檢疫水平，保護我國生豬養(yǎng)殖及發(fā)展中的應(yīng)用和前景。

[關(guān)鍵詞] 免疫學(xué)技術(shù) 生豬屠宰檢疫

[中圖分類號] S85 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1003-1650（2014）04-0233-01

一、我國生豬屠宰檢疫的現(xiàn)狀

目前我國生豬屠宰機械化、規(guī)模化程度逐漸增高，大型生豬屠宰加工企業(yè)也紛紛建廠擴展。另一方面，動物疫病日益紛雜，許多疫病在臨床表現(xiàn)、病理變化上都具有高度的相似性，難以區(qū)分。加強動物檢驗檢疫，提高動物檢驗檢疫的水平，一方面可有效防止病害生物進入我國，保障我國動物產(chǎn)品的養(yǎng)殖安全與生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定；另一方面能控制疾病從疫區(qū)向非疫區(qū)傳播，減少疾病發(fā)生，提高動物產(chǎn)品的質(zhì)量，維護我國動物產(chǎn)品的國際信譽，從而促進產(chǎn)品出口。在此背景下，生豬屠宰檢疫水平、檢疫技術(shù)也必須提高以適應(yīng)相應(yīng)的要求。但目前在生豬屠宰檢疫過程中，大部分卻依賴于檢疫人員“一個鉤、一把刀、一雙手、兩只眼”來從事檢疫工作，幾十年來未有新的、快速的檢疫方法得以應(yīng)用。

二、免疫學(xué)技術(shù)與生豬屠宰檢疫

免疫學(xué)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快的學(xué)科之一，尤其是免疫學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展，把傳統(tǒng)免疫學(xué)推進到現(xiàn)代免疫學(xué)的新時代。近年來不斷涌現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫、酶標(biāo)記免疫、核素標(biāo)記免疫、生物素和熒光素標(biāo)記免疫、金標(biāo)記與稀土元素標(biāo)記免疫等成為全新的技術(shù)門類，極大地豐富了現(xiàn)代免疫技術(shù)領(lǐng)域，而且免疫學(xué)與分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科和交叉學(xué)科的融合，對免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展起著極大的推動作用。

三、免疫學(xué)技術(shù)在生豬屠宰檢疫的應(yīng)用

1.凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)及其應(yīng)用

1.1凝集反應(yīng)

顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊，這種反應(yīng)稱之為凝集反應(yīng)。目前可用凝集反應(yīng)檢疫的疫病主要有：豬布魯氏菌病、豬支原體肺炎、豬囊蟲病、豬萎縮性鼻炎、豬乙型腦炎、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、副豬嗜血桿菌等。

1.2沉淀反應(yīng)

可溶性抗原（細(xì)菌培養(yǎng)濾液、細(xì)胞或組織的侵出液、血清蛋白等）與相應(yīng)抗體在一定條件下出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象，稱之為沉淀反應(yīng)。目前可用沉淀反應(yīng)檢疫的疫病主要有：豬旋毛蟲病、炭疽、豬支原體肺炎、豬鏈球菌病等。

2.免疫標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用

2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗

一種酶聯(lián)免疫技術(shù)。用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標(biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。目前可用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢疫的疫病主要有：豬囊蟲病、豬瘟、豬旋毛蟲病、豬乙型腦炎等。

2.2免疫組化技術(shù)

免疫組織化技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進行組織和細(xì)胞原位檢測技術(shù)。目前可用免疫組化技術(shù)檢疫的疫病主要有：豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒等。

3.其他用標(biāo)記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)

其他用標(biāo)記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)主要包括免疫熒光技術(shù)、放射免疫測定技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、免疫斑點技術(shù)、等等。其中應(yīng)用最為廣泛的是膠體金免疫層析技術(shù)。膠體金免疫層析（GICA）技術(shù)是20世紀(jì)90年代初在免疫滲濾技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，由Beggs等最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定。GICA是以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，如同層析一般。目前可用于檢疫的疫病有：豬繁殖與呼吸綜合征、豬鏈球菌2型、豬瘟、豬偽狂犬病、豬口蹄疫、豬旋毛蟲等。

總之，檢測動物或動物產(chǎn)品病原體的方法很多。有核酸水平的診斷技術(shù)（例如PCR技術(shù)），也可通過高性能的電子顯微鏡直接觀察到病原體。但是大多數(shù)技術(shù)所需的時間較長，且對于設(shè)備有一定的要求。而免疫學(xué)檢測技術(shù)的檢測時間較短，且無需大型的設(shè)備和復(fù)雜的程序，因此免疫學(xué)檢測作為一種傳統(tǒng)而有效的檢測技術(shù)，應(yīng)被廣泛應(yīng)用于動物檢驗檢疫工作中。

第五篇：流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用(課件)

流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用-------溫醫(yī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

第一節(jié) 概述

第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析

第三節(jié) 流式細(xì)胞儀技術(shù)要求

一、工作原理

一、參數(shù)

一、免疫檢測樣品制備

二、散射光的測定

二、數(shù)據(jù)顯示方式

二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色

三、熒光測量

三、設(shè)門分析技術(shù)

三、免疫膠乳顆粒的應(yīng)用

四、細(xì)胞分選原理

四、流式細(xì)胞技術(shù)的質(zhì)量控制

第四節(jié) 流式細(xì)胞儀技術(shù)的要求

第五節(jié)、流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用

第六節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測中的主要應(yīng)用 ? 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)亦稱熒光激活細(xì)胞分選器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。/是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。/廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐各個方面，包括細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗學(xué)等。

? 流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史

1930年Caspersson和Thorell開始致力于細(xì)胞計數(shù)的研究

1934年Moldaven最早設(shè)想細(xì)胞檢測自動化，用光電儀記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞 1940年Coons提出結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申請了在懸液中計數(shù)粒子的方法的專利 1950年Caspersson用顯微UV-VIS檢測細(xì)胞

1953年Croslannd-Taylor應(yīng)用分層鞘流原理，成功設(shè)計紅細(xì)胞光學(xué)自動計數(shù)器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM發(fā)明第一臺熒光檢測細(xì)胞計 1972年Herzenberg研制出細(xì)胞分選器

1975年Kohler等提出單克隆抗體技術(shù)，為細(xì)胞研究提供大量的特異免疫試劑

目前國內(nèi)主要流式細(xì)胞儀廠家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

? 流式細(xì)胞術(shù)的特點：最大的特點是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細(xì)胞進行定量分析或純化分選。細(xì)胞不被破壞，測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量

主要特點 ：1.單個細(xì)胞水平分析；2.多參數(shù)分析（同時多種熒光素標(biāo)記）水平分析；3.靈敏度高；4.可分析大量細(xì)胞；5.速度快： 5000-10000個細(xì)胞/秒；6.統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況；7.分選感興趣的細(xì)胞：血細(xì)胞、骨髓、組織培養(yǎng)細(xì)胞等。

第一節(jié) 概述

流式細(xì)胞儀是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強度的細(xì)胞分析儀，是在單個細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。分為三大類：(1)類為臺式機（臨床型）：儀器的光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學(xué)易掌握。(2)類為大型機（科研型）特點：分辨率高，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來，并可以將單個細(xì)胞或指定個數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或培養(yǎng)板上，同時可選配多種波長和類型的激光器，適于更廣泛更靈活的科學(xué)研究應(yīng)用。(3)類為新型流式細(xì)胞儀：15 個參數(shù)同時分析。高速分選速度達(dá)到50,000 個/秒，并可進行遙控分選，能夠滿足多種科學(xué)研究的要求。流式細(xì)胞儀常檢測的細(xì)胞特性 細(xì)胞組成 細(xì)胞功能

一、工作原理 大小

細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原

①采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā) 粒度

細(xì)胞活性

效率；②利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，DNA, RNA含量

胞內(nèi)細(xì)胞因子

保證檢測的靈敏度和特異性；③用計算機系統(tǒng)對流動的單細(xì) 蛋白質(zhì)含量

激素結(jié)合位點

胞懸液中單個細(xì)胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證 鈣離子, PH值, 膜電位 酶活性

了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。概括為三個系統(tǒng)結(jié)構(gòu)：（1）液流系統(tǒng)：由樣本和鞘液組成。鞘液（PBS或生理鹽水）：主要作用是包裹樣本流的周圍，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，包裹的細(xì)胞排列成單行，以每秒5000個-10000個細(xì)胞，每秒10米速度流動室噴出，保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。鞘液在整個系統(tǒng)運行中流速是不變的。改變樣本的進樣速率開關(guān)，可提高采樣分析的速度。

（2）光學(xué)系統(tǒng)：大多采用氬離子氣體激光器。每個細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用-------溫醫(yī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù) 的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強度。激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡形成光斑，這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞受到的光照強度一致。激光光束與細(xì)胞液流呈90°角方向照射，細(xì)胞產(chǎn)生散射光和熒光。

主要光學(xué)原件是濾光片，主要分成3 類：

1、長通濾片：（LP）：LP500濾片允許500μm 以上光通過，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通濾片（SP）：與長通濾片相反，如SP500 濾片允許500μm 以下光通過，500μm 以上光吸收或返回。

3、帶通濾片（BP）：帶通濾片可允許相當(dāng)窄的一波長范圍內(nèi)光通過，一般濾片上有兩個數(shù)，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光的波段范圍。如BP500 表示其允許通過波長范圍為75μm-525μm。

（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別

區(qū)別

流式細(xì)胞儀

顯微鏡

光源

激光

自然光、燈光 對象

細(xì)胞、生物粒子

細(xì)胞、組織等 承載工具 鞘液及流動室

載玻片 檢測信號 光學(xué)信號

形態(tài)及染色 放大方式 PMT、放大電路 目鏡×物鏡、光學(xué)放大 統(tǒng)計

計算機，>5000 人工，200 結(jié)果

多參數(shù)，綜合分析 簡單，單參數(shù)

二、散射光的測定

散射光信號不依賴任何樣品的制備技術(shù)（如染色），因此稱為細(xì)胞的物理參數(shù)。（波長與激光相同。）主要分為: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細(xì)胞體積大小成正比。

②側(cè)向散射光（90°散射）SSC：激光束照射細(xì)胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒屬性，即細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)。

目前采用FSC（表示細(xì)胞大?。㏒SC（表示細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度）這兩個參數(shù)組合，檢測FSC與SSC信號通過計算機處理，可得到FSC-SSC圖，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞三個細(xì)胞群體，或在未進行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。

三、熒光信號（FL）測量

當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時，一般產(chǎn)生兩種熒光信號：

①一種是細(xì)胞自發(fā)熒光：細(xì)胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號；

②另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，由于 90o 方向的散射光信號較弱，容易分離出熒光信號，因此此方向上放置必要的光學(xué)元件（濾光片、雙色分光鏡等），可以獲取熒光信號。

通過收集兩種以上不同波長的熒光信號FL1、FL2進行檢測和定量分析，就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量，反映生物顆粒表面和內(nèi)部的各種情況。

常配置的激光器波長為488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

熒光信號的寬度（如FL2-W）常用來區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞，由于DNA 樣本極易聚集，當(dāng)兩個G1 期細(xì)胞粘連在一起時，其測量到的DNA 熒光信號（FL2-A）與G2M 期細(xì)胞相等，這樣得到的測量數(shù)據(jù)G2M 期細(xì)胞比率會增高，影響測量準(zhǔn)確性。通過設(shè)”門”（gate）方法，將雙聯(lián)體細(xì)胞排除。其原理是雙聯(lián)體細(xì)胞所得到的熒光寬度信號（FL2-W）要比單個G2M 細(xì)胞大，因此設(shè)”門”后才能得到真正的DNA 含量分布曲線和細(xì)胞周期。不過通過熒光強度的高度峰和面積峰也可做同樣分析。

四、細(xì)胞分選原理（圖示見上）

通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選主要是在對具有某種特征的細(xì)胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。快速精度分選純度90%-99%，且細(xì)胞活性不受影響。

1、細(xì)胞分選時，液流在驅(qū)動力作用下斷成高度均一的液滴。在噴嘴下幾毫米處，液滴從液流斷開。

2、從顆粒被檢測到液滴斷開的時間由Accudrop技術(shù)直接計算。

3、符合分選條件的顆粒一旦被檢測到，包含該顆粒的液滴斷開時，液滴被充電。斷開后的液滴仍然帶電，帶電的液 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用-------溫醫(yī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

滴通過被充電的偏轉(zhuǎn)板。受到靜電吸引或排斥，帶電液滴將向左或右偏轉(zhuǎn)。未帶電的液滴不偏轉(zhuǎn)而流入廢液槽。檢測指標(biāo)：陽性百分率、絕對計數(shù)、平均熒光強度

（二）FCM 分選指標(biāo)

分選速度：單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。一般要求分選速度至少達(dá)5 000個／秒左右，以保證被分選細(xì)胞的生物學(xué)活性不受影響。

分選純度：被分選出的細(xì)胞所占的百分比，分選純度與儀器的精密度直接相關(guān)，與實驗設(shè)計的選擇密切相關(guān)，可達(dá)到99%。

分選收獲率：實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。

分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率。與分選速度成反比。第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析

常用數(shù)據(jù)顯示方式：單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖、設(shè)門分析技術(shù)

目前FCM 數(shù)據(jù)存貯的方式：采用列表排隊方式。目前FCM 所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光參數(shù)標(biāo)記物如是4 個，采用list mode 方式可大量地節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。當(dāng)一個細(xì)胞被測4 個參數(shù)，那么獲取10000 個細(xì)胞，所占容量為4×10000 個（字或雙字）。同時當(dāng)只檢測1 個參數(shù)時（如DNA），可靈活的關(guān)閉其它3 個參數(shù)，節(jié)省3/4 的空間數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種。

一、參數(shù)

FSC：反映顆粒的大小。SSC：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度。FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少。

二、數(shù)據(jù)顯示方式

（一）單參數(shù)直方圖---------由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。橫坐標(biāo)表示熒光信號或散射光信號相對強度（FSC、SSC、FL1、FL2）四個參數(shù)的任何一個值。其單位是信道，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。

（二）雙參數(shù)直方圖---------雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細(xì)胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。常用的表達(dá)方法有二維點圖,等高線圖,二維密度圖。在二維圖中，任選FSC、SSC、FL1、FL2 中二個參數(shù)作為X 軸、Y軸，在二維圖上每個點代表一個細(xì)胞，可以區(qū)分細(xì)胞性質(zhì)不同的群體；X 坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)的相對含量，而Y 坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量。在雙參數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開，同時可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息。

（三）二維等高圖---------由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。

（四）三參數(shù)直方圖---------在三維圖中，任選FSC、SSC、FL1、FL2 中二個參數(shù)作為X 軸、Y軸，Z軸為細(xì)胞數(shù)，構(gòu)成三維圖。

（五）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析---------多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。

三、設(shè)門分析技術(shù)

Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四節(jié) 流式細(xì)胞儀技術(shù)的要求

一、免疫檢測樣品制備

細(xì)胞樣品制備要求：

1、單細(xì)胞懸液；

2、細(xì)胞最適密度0.5×106-1.5×106個/ml；

3、熒光染色后盡量洗凈細(xì)胞外多余染料，減少熒光本底；

4、雙染色時盡量選擇發(fā)射光譜不接近的熒光色素，產(chǎn)生易區(qū)別的兩種熒光顏色；

5、如果細(xì)胞分選后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞樣品制備和上機應(yīng)該無菌操作。外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備：分離單個核細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備：蛋白酶消化-----機械吹打-----使貼壁細(xì)胞脫落-----洗滌-----尼龍網(wǎng)過濾 新鮮實體組織單細(xì)胞懸液的三種制備：

單細(xì)胞懸液的保存： 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用-------溫醫(yī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

機械法（金屬網(wǎng)引起細(xì)胞破碎）

深低溫保存法（一年）酶處理法（選擇最適宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化學(xué)試劑處理法（導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性劑處理法 注意事項：

1、新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時進行處理保存；

2、根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最隹的固定方法；

3、酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH 值、濃度等方面對酶消化法的影響。

4、需注意不同組織，選擇相應(yīng)的方法；如富于細(xì)胞的組織——淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等，不一定采用酶學(xué)法或化學(xué)法；往往用單純的機械法就可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細(xì)胞；

5、在使用酶學(xué)方法時，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤——食管癌、乳腺癌、皮膚癌等，選用膠原酶較好。

二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色 適用條件: ①有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)；②熒光強度與光量子產(chǎn)額之間的關(guān)系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示熒光強度，Q 表示光量子產(chǎn)額，I 表示激發(fā)光強度，￡表示消化系數(shù)，C 表示染液濃度，L 表示溶液厚度。③對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收；④發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差；⑤易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性 熒光素發(fā)射熒光的基本原理：熒光素受到一定波度（激發(fā)波長）的激光激發(fā)后，其原子核外的電子由于吸收了激光的能量，由原本運動處于基礎(chǔ)態(tài)軌道躍遷到激發(fā)態(tài)軌道上運動，然后當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)重新回到基礎(chǔ)態(tài)時，釋放出能量并發(fā)射出一定波長（發(fā)射波長）的熒光。

1、要選擇正確的激光器：不同熒光素用不同的激發(fā)光波長的激發(fā)光來激發(fā)：

FITC 和PE 等的激發(fā)波長均為488nm，用產(chǎn)生可見光的氬離子激光器；APC 和PC5 等的激發(fā)波長在紅光范圍，需使用發(fā)射630nm 波長紅光的氦-氖激光器。

2、各種熒光素的發(fā)射波長也十分重要，據(jù)此可以確定其檢測所需光電倍增管性質(zhì)； 如FITC，被激光激發(fā)后發(fā)射綠光，檢測時要使用第一光電倍增管（即PMT1）；PE 則發(fā)射橙色光，需用第二光電倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，發(fā)射的是深紅色光，這時需選擇第三甚至第四光電倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的幾類熒光染料

（二）免疫熒光標(biāo)記

名稱染料激發(fā)發(fā)射光溶解性對PH敏感特點熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方波長或熒光性式

結(jié)構(gòu)親和式

顏色

嵌入結(jié)合 共價鍵結(jié)合 異硫氰酸熒FITC488綠 易敏感易溶于水，與抗體結(jié)光素合不影響特異性52

5熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合 得州紅Texas 568紅 不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)免疫熒光標(biāo)記方法

red額低615直標(biāo)：干擾少,但需購買多種單抗

藻紅蛋白PE488橙間標(biāo)：步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種575抗體

易不敏感具較多發(fā)光基團，消藻青蛋白PC488紅組合標(biāo)記

光系數(shù)和量子產(chǎn)額高

別藻青蛋白APC633紅 670 能量傳遞復(fù)PEcy5488紅易不敏感減少交叉，成本高 合染料670

三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用-----液相芯片技術(shù)

是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用-------溫醫(yī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

四、流式細(xì)胞技術(shù)的質(zhì)量控制

（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控

（二）免疫熒光染色的質(zhì)控 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞剑ú煌瑯?biāo)本來源外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞等）

溫度 試劑選擇

pH 樣品處理（蛋白質(zhì)濃度、緩沖液、細(xì)胞條件、活性、自發(fā)熒光等）

染料濃度 實體組織來源標(biāo)本用機械法

固定劑 溫度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）儀器操作的質(zhì)控

光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn): 保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準(zhǔn): 保證計數(shù)的準(zhǔn)確性。

（四）免疫檢測的質(zhì)控

同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實驗結(jié)果可靠。第五節(jié)、流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用

1、細(xì)胞表型分析

2、胞內(nèi)蛋白的檢測

3、細(xì)胞周期和DNA倍體分析

4、流式標(biāo)準(zhǔn)小球定量

5、分選

6、細(xì)胞內(nèi)鈣離子測量

第六節(jié)、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用

1、細(xì)胞周期和DNA含量分析

2、細(xì)胞凋亡的檢測和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干細(xì)胞（CD34+細(xì)胞）的檢測

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析

7、殘余白血病檢測

8、淋巴細(xì)胞亞群分析

9、腫瘤耐藥基因分析

10、AIDS病檢測中的應(yīng)用

11、自身免疫病相關(guān)HLA抗原分析

12、移植免疫中的應(yīng)用

1、DNA 含量分析檢測原理：DNA 含量常和某種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白同時檢測，來分析細(xì)胞處于某一特定周期階段。惡變腫瘤細(xì)胞一般多出現(xiàn)異倍體，有很多研究證明DNA 含量分析對人腫瘤的診斷預(yù)后有很高的價值。熒光染料和細(xì)胞 DNA 分子特異性結(jié)合具有一定的量效關(guān)系： ① DNA 含量多少與熒光染料的結(jié)合成正比；

② 熒光強度與DNA 分子結(jié)合熒光素多少成正比；

③ 熒光脈沖與直方圖的通道值成正比。因此，F(xiàn)CM-DNA 定量分析1 個細(xì)胞增殖群時，可將二倍體DNA 含量分布組方圖分為三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 細(xì)胞峰的DNA 分布均為正態(tài)分布，S 期可以認(rèn)為是一個加寬的正態(tài)分布。在癌組織DNA 直方圖上，異倍體峰前總可以見到1 個或大或小的二倍體峰位的G0/1 細(xì)胞峰。另外，顯微圖象分析儀做異倍體檢測時，都采用組織中淋巴細(xì)胞做對照。

在同一個腫瘤的不同區(qū)域、或原發(fā)腫瘤和繼發(fā)、或轉(zhuǎn)移灶、或隨腫瘤病程發(fā)展、或經(jīng)治療的腫瘤灶，其DNA 倍性可能有所變化，這種倍體類型的差異，稱為DNA 倍體異質(zhì)性。DNA分析的臨床意義

DNA分析診斷腫瘤：----DNA非整倍體細(xì)胞峰-----突出的四倍體細(xì)胞峰

DNA倍體分析：結(jié)合臨床病理的形態(tài)學(xué)診斷，對一些惡性腫瘤進行早期診斷，跟蹤隨訪和早期治療，大大提高一些腫瘤的治愈率和生存率。尤其對一些細(xì)胞抽吸物、體液、組織液的脫落細(xì)胞的分析，意義尤為重要。增殖狀態(tài)分析：反映了腫瘤的生長速度和侵襲性 FCM在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用

DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要標(biāo)志 在病理形態(tài)學(xué)不能做出診斷前可提供確切診斷信息 DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性對待

形態(tài)學(xué)表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能 DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo) 細(xì)胞凋亡------（1）、早期細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

-------（2）晚期細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測：DNA 含量分析法：目前檢測凋亡細(xì)胞DNA 斷裂的方法中，最常用、最簡便的就是DNA 含量分析；DNA 直方圖上顯示在G0/1 峰前出現(xiàn)一個DNA 含量減少的亞二倍體或稱亞G0/1 峰，又稱凋亡細(xì)胞峰