第一篇：微生物的培養(yǎng)與生長

第四章

微生物的培養(yǎng)與生長

所有生物為了生存都必須不斷地從外界環(huán)境中吸收所需的各種物質(zhì)從中獲得 原料和能量以便合成新的細(xì)胞物質(zhì)，生物所需的這些物質(zhì)稱之為營養(yǎng)物質(zhì)。生物吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程一般稱為營養(yǎng)。營養(yǎng)物質(zhì)是生物進行一切生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，失去這個基礎(chǔ)，一切生物都無法生存，微生物也不例外?？梢姡瑺I養(yǎng)對微生物的重要性。

第一節(jié) 微生物的營養(yǎng)

一、微生物細(xì)胞的化學(xué)組成

分析微生物細(xì)胞化學(xué)組成是了解微生物營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)。主要成分：C、H、N、O和無機成分。其中主要是水分、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、核酸和無機鹽。水分占90-97，其余占3-10%。

二、營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能

微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、無機鹽類和生長素。這些物質(zhì)對微生物的生命活動主要有三方面的作用：

（1）、供給微生物合成細(xì)胞物質(zhì)的原料；（2）、合成代謝和生命活動所需的能量；（3）、調(diào)節(jié)新陳代謝。

（一）、碳源

碳源主要用來供給菌體生命活動所需的能量，構(gòu)成軍菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物。常用的碳源有：糖類、脂肪和某些有機酸、部分醇類。

在某些特殊情況（如碳源貧乏），蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或氨基酸等也可以被某些菌種作為碳源使用。由于菌種所含煤系統(tǒng)并不完全相同，所以，各種菌能利用的碳源亦不相同。

葡萄糖、麥芽糖、乳糖等單糖和雙糖是絕大部分細(xì)菌、酵母菌、放線菌及霉菌可利用的碳源，大多數(shù)霉菌、放線菌和部分細(xì)菌可直接利用糊精和淀粉作為碳源。

（二）、氮源

氮源主要用來構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)）和含氮代謝產(chǎn)物。常用的氮源可分為兩類：有機氮源和無機氮源。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、魚粉等屬于有機氮源；氨水、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、硝酸銨和磷酸氫二銨等為無機氮源。

（三）、水

水是微生物體內(nèi)外的溶媒，只有通過水，微生物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)才能進入細(xì)胞，也只有通過水其代謝產(chǎn)物才能排出體外。另外，水也可以直接參加代謝作用，如蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪的水解作用都是在水參與下才能進行的。

（四）、無機鹽

無機鹽也是微生物生長所必不可少的營養(yǎng)物，其中又可分為主要元素和微量元素兩大類。主要元素微生物需要量大，有P、S、Mg、K、Ca、Na等，它們參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，有調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)pH值和氧化還原電位的作用，有能量轉(zhuǎn)移、控制原生質(zhì)膠體和細(xì)胞透性的作用。微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn、Co等，它們的需要量 雖然極微，但往往強烈地刺激微生物的生命活動。它們或是酶活性基的組成成分或酶的激活劑。

（五）、生長因子

有些微生物在含有碳源、氮源、無機鹽的培養(yǎng)基中仍不能正常生長，如在培養(yǎng)基中加入某種組織（或細(xì)胞）提取液時，則微生物生長良好，說明這種組織中含有某些微生物生長所需的生長因子。凡是微生物生長所不可缺少的微量有機物都稱為生長因子。包括維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物。

這些物質(zhì)之所以稱之為生長因子，是由于某些微生物自己不能合成之，必須由外界提供。它不是一切微生物所必需的。

第一類是不需要外源供給的微生物，像自養(yǎng)型細(xì)菌和廣泛分布的一些腐生性細(xì)菌和霉菌，它們自己可以合成這些物質(zhì)，以滿足自身 的需要。

第二類是缺乏自制一種或兩種能力的微生物，如金黃色葡萄球菌需要硫胺素，根瘤菌需要生物素。這類微生物中有些種類，當(dāng)外界供給所需要的前體物質(zhì)，亦能滿足需要。

第三類為對多種維生素、氨基酸、堿基都缺乏合成能力的微生物，在培養(yǎng)基中提供水解蛋白質(zhì)和織物組織液才能生長（如麥芽汁、酵母汁）。

維生素作為酶的活性基團起催化作用。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，嘌呤、嘧啶是合成核苷酸的主要物質(zhì)。

三、微生物的營養(yǎng)類型

由于各種微生物的生活環(huán)境和對物質(zhì)的利用能力不同，它們對營養(yǎng)的需要和代謝方式也不盡相同，根據(jù)微生物所需要的營養(yǎng)和能量的不同，尤其是碳素營養(yǎng)來源的不同，可把它們分成自養(yǎng)微生物和異養(yǎng)微生物兩大類。

自養(yǎng)型微生物：能利用簡單的無機物作為營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖，能以CO2或碳酸鹽為碳源，以氨或硝酸鹽為氮源，在體內(nèi)合成有機物，不需要外界供給有機物。

異養(yǎng)型微生物：只能用現(xiàn)成的有機物作為碳源，如單糖、雙糖、淀粉、纖維素、有機酸等，另外，根據(jù)能量來源不同，又可分為兩種類型。即光能營養(yǎng)型和化能營養(yǎng)型。光能營養(yǎng)型能利用光能?；軤I養(yǎng)型是來自物質(zhì)氧化過程釋放的能量。

根據(jù)碳素來源和能量來源可分四種類型。

（1）、光能自養(yǎng)型：這類微生物利用日光作為其生活所需的能源，利用CO2作為碳源，以無機物為供氫體來還原CO2,合成細(xì)胞有機物質(zhì)。如藍(lán)細(xì)菌（光合細(xì)菌）。

（2）、光能異養(yǎng)型：有少數(shù)微生物種類具有光合色素，能利用光能把CO2還原為碳水化合物，但必須以某種有機物為CO2同化中的供氫體。如紅螺菌屬利用丙醇作為供氫體，積累丙酮。

（3）、化能自養(yǎng)型：能利用氧化無機物時產(chǎn)生的能量，把CO2還原成有機碳水化合物。如硝化細(xì)菌、鐵細(xì)菌等。

（4）、化能異養(yǎng)型： 能源來自有機物 的氧化或發(fā)酵產(chǎn)生的化學(xué)能，以有機物為碳源，以有機或無機氮為氮源。這類微生物的種類最多。

四、微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收方式

微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收取決于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和生物功能。細(xì)胞膜是一層具有高度選擇性的半透膜，控制營養(yǎng)物質(zhì)及 代謝產(chǎn)物的進出細(xì)胞。細(xì)胞膜上有豐富的酶，這些酶與物質(zhì)的吸收和排泄有關(guān)。微生物對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的機制有四種：

1、被動擴散：由高濃度向低濃度擴散。

2、助長擴散：有載體蛋白參加。

3、主動運輸：從低濃度向高濃度擴散，需要能量和載體蛋白。

4、基因轉(zhuǎn)移：通過磷酸化轉(zhuǎn)移。

五、培養(yǎng)基

微生物的生長和繁殖需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要，經(jīng)過人工配制適合比同微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)就成為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的主要用途為：促使微生物生長與繁殖，用于微生物純種分離、鑒定 和制造微生物制品等。

（一）、培養(yǎng)基的類型

由于各種微生物所需要的營養(yǎng)物不同，所以培養(yǎng)基的種類也有很多種，估計可有數(shù)千種之多，但大致可以分為以下幾類。

1、根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)來分

（1）、合成培養(yǎng)基：是由已知化學(xué)成分及數(shù)量的化學(xué)藥品配制而成的。這種培養(yǎng)基成分精確，重復(fù)性強。但價格高，一般多用于實驗室內(nèi)供研究有關(guān)微生物的營養(yǎng)、代謝、分離和鑒定生物制品及選育菌種用。

（2）、天然培養(yǎng)基：采用化學(xué)成分還不十分清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機物，可用組織提取液等。如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨、牛奶、血清等。玉米粉、馬鈴薯配制方便、經(jīng)濟，運用于實驗室和生產(chǎn)。

（3）、半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎(chǔ)上，加入一些化學(xué)藥品，以補充無機鹽成分，使其更能充分滿足生長需要。該培養(yǎng)基是使用最多的培養(yǎng)基。

2、根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀分

（1）、固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，成為固體狀，用于菌種保藏、分離、菌落特征觀察、計數(shù)等。

（2）、液體培養(yǎng)基：一般用于生產(chǎn)。

（3）、半固體培養(yǎng)基：加入0.35%-0.40%瓊脂。

3、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來分

（1）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基：滿足一般微生物生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)。

（2）、加富培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入額外的營養(yǎng)物質(zhì)，使某些微生物在其中生長，而不適合其它微生物生長。通常加入血、血清、動植物提取液。

（3）、選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)藥品以抑制不需要的微生物生長，而促進需要的微生物生長，往往加入一些抑菌劑或殺菌劑。

（4）、鑒別培養(yǎng)基；根據(jù)微生物能否利用培養(yǎng)基中的某種成分，依靠指示劑的顏色反應(yīng)，借以鑒別不同種類的微生物。

（二）、培養(yǎng)基配制的原則

1、根據(jù)微生物的營養(yǎng)要求配制；

2、注意營養(yǎng)成分的比例；

3、培養(yǎng)基的pH值；

4、氧化還原電位。

第二節(jié)

微生物的生長

一、微生物的生長

微生物在適宜的環(huán)境中，按照自己的代謝方式，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行新陳代謝，即進行同化作用和異化作用。如果同化作用大于異化作用，細(xì)胞會增大，細(xì)胞的體積逐漸增加，這就是生長。細(xì)胞的生長有一定限度的，當(dāng)增到一定限度時，細(xì)胞就開始分裂，形成兩個基本相似的子細(xì)胞，子細(xì)胞又可重復(fù)進行生長和分裂。細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞，使個體數(shù)目增加，這就是分裂。從生長到繁殖的過程也就是由量變到質(zhì)變的 發(fā)展過程，這一質(zhì)變過程叫發(fā)育。微生物在比較合適的條件下，能正常生長和繁殖。當(dāng)環(huán)境發(fā)生某些變化，此變化超過了微生物能適應(yīng)忍受的程度時，微生物的生命活動就會受到抑制而發(fā)生變異，甚至死亡。

細(xì)菌的生長的標(biāo)志：以群體數(shù)目的增加作為生長標(biāo)志。因為很難將生長與繁殖分開。

放線菌和霉菌：是以菌絲的伸長和分枝表現(xiàn)為生長的。

對于微生物的應(yīng)用，不論是在食品和其他方面的應(yīng)用，主要是利用它的菌體，及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和酶類，而這與微生物的生長是密切相關(guān)的。所以了解和掌握微生物的生長特性是很有必要的。

二、微生物的純培養(yǎng)

目的是從混雜狀態(tài)中純化分離細(xì)菌，是研究利用微生物的基礎(chǔ)，通常采用以下方法：

1、稀釋平板法；

2、劃線法；

3、單細(xì)胞分離法；

4、選擇培養(yǎng)基分離法。

此部分試驗指導(dǎo)中也有，在此簡單介紹。

三、微生物生長的測定

（一）、單細(xì)胞的微生物是指細(xì)菌和酵母菌等，它們的生長量不是測定細(xì)胞大小，而是測定群體增長量。方法如下：

1、全數(shù)測定

所謂全數(shù)測定，即是培養(yǎng)一定時間后測定細(xì)胞的總數(shù)。其數(shù)量既包括活的細(xì)胞，也包括死的細(xì)胞。

（1）、計數(shù)器法：采用血球計數(shù)板。

（2）、染色涂片計數(shù)法：取定量菌液將其涂布于1cm2的面積內(nèi)，染色、鏡檢、計數(shù)。

（3）、比濁法：是測定菌液中細(xì)胞數(shù)的快速方法，原理是菌液中細(xì)胞量越多，濁度越大。用未知細(xì)胞數(shù)的菌液和已知細(xì)胞數(shù)的菌液相比，來求出未知細(xì)胞數(shù)菌液中的細(xì)胞數(shù)。

2、活菌計數(shù)法：測定活菌數(shù)。（1）稀釋平板法：取待測的細(xì)胞懸液作一系列的稀釋，稀釋級數(shù)越高，稀釋液中含細(xì)胞數(shù)愈少，也就越易在培養(yǎng)皿上顯出單個菌落。

（2）、液體稀釋培養(yǎng)法：采用統(tǒng)計學(xué)原理進行測定，如大腸菌群的測定，采用此方法。

（二）、多細(xì)胞微生物生長的測定

以菌絲生長的長度或菌絲增加的重量作為生長指標(biāo)。最簡單的方法是將酶菌接種在培養(yǎng)皿內(nèi)固體培養(yǎng)基中央，在一定時間內(nèi)測定菌落的直徑或面積。對生長速度快的霉菌，可每24h測量一次。可求出菌絲的平均生長速度。

（三）、細(xì)胞物質(zhì)的測定

測量活菌或死菌。

1、干重法：過濾或離心，烘干稱重。

2、含氮量法：細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量比較穩(wěn)定。而氮又是蛋白質(zhì)的重要組成。因此，測定微生物細(xì)胞的含氮量來表示其生長情況。

四、生長曲線

是指細(xì)菌等單細(xì)胞微生物，以細(xì)胞增長數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)作圖時，可以繪出一個曲線，此曲線稱為生長曲線。

細(xì)菌純培養(yǎng)的生長曲線：由于細(xì)菌各個時期生長繁殖速度不同，所以，生長曲線又可分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。

（一）、延遲期

少量的細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基后，開始時，細(xì)胞一般不立即進行繁殖。因此，它們的細(xì)菌數(shù)幾乎不增加，甚至還有減少。生長曲線中的這一段時間稱為延遲期。

處于延遲期的細(xì)菌體積增長較快，特別是在此期的末期。

延遲期的出現(xiàn)可能是因為細(xì)胞在新的環(huán)境中，需要合成新的必需的酶、輔酶或某些中間代謝產(chǎn)物，或者為了適應(yīng)新環(huán)境而出現(xiàn)的調(diào)整代謝的時間。延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡及移種到新鮮培養(yǎng)基前后所處的環(huán)境條件是否相同等因素有關(guān)。

繁殖速度較快的菌種接種時，其延遲期也較短，甚至檢查不到延遲期；接種到同樣組成的培養(yǎng)基比接種到組成不同的培養(yǎng)基中，其延遲期要短些；增大接種量可縮短甚至消除延遲期。

由于延遲期的長短能影響微生物的正常生長周期，在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中延長生產(chǎn)周期，會降低設(shè)備的利用率。所以，生產(chǎn)實踐中總是設(shè)法縮短延遲期。為此，采取的措施有：

（1）、增加接種量；（2）、用對數(shù)生長期的菌種；（3）、用健壯的菌種；

（4）、在種子培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些成分；（5）、采用最適種齡等。

（二）、對數(shù)期

在延遲期末，細(xì)胞開始出現(xiàn)較大量的分裂，培養(yǎng)基中的菌數(shù)急劇增加，進入了對數(shù)期。在此期內(nèi)，如用菌數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖時，則該線呈一條直線，此期為對數(shù)期。

對數(shù)期的菌數(shù)按幾何級數(shù)增加。即1個細(xì)菌繁殖幾代，產(chǎn)生2n個細(xì)胞。對數(shù)生長期的菌體代謝活躍，消耗營養(yǎng)多，生長速率高，個體數(shù)目顯著增多。另外，群體中的細(xì)胞化學(xué)組成與形態(tài)、生理特征等比較 一致，這一時期的菌種 很健壯，因此，在生產(chǎn)上常用它作為接種的種子。

實驗室也多用對數(shù)期的細(xì)胞作為試驗材料。通常對數(shù)期維持的時間較長，但它也受營養(yǎng)及環(huán)境條件所左右。

（三）、穩(wěn)定期

在一定的培養(yǎng)液中，細(xì)菌不可能按對數(shù)期的高速率無限地生長繁殖，這是由于對數(shù)期中細(xì)菌的活躍生長已經(jīng)消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，所以，在對數(shù)期末，細(xì)菌生長速率逐漸下降，死亡率大量增加，以致使新增值的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)趨于平衡，因此活菌數(shù)保持相對的穩(wěn)定，成為穩(wěn)定期。

處于這個期的細(xì)胞生活力逐漸減弱，開始大量儲存代謝產(chǎn)物。同時，也積累了許多不利于微生物活動的代謝產(chǎn)物。由于微生物的生長改變了它自己的生活條件，出現(xiàn)了不利于細(xì)菌生長的因素，如pH值、氧化還原電位等，致使大都數(shù)芽孢桿菌在這個生長階段形成芽孢。

由于穩(wěn)定期有大量代謝產(chǎn)物積累，人們要獲得其代謝物質(zhì)，可在這一時期提取。在此穩(wěn)定期內(nèi)，活菌數(shù)達到最高水平。如要得到大量菌體，也應(yīng)在此期開始收獲。穩(wěn)定期持續(xù)時間長短取決于菌種的繁殖與衰亡的數(shù)量之比。環(huán)境條件對穩(wěn)定期的長短也有影響。

（四）、衰亡期

穩(wěn)定期后，如再繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌死亡率逐漸增加，以致使死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，總的活菌數(shù)明顯下降，即死亡期。其中，有一階段活菌數(shù)以幾何數(shù)下降。因此，也稱為對數(shù)衰亡期。

這個時期，細(xì)菌菌體常出現(xiàn)多種形態(tài)，包括畸形和衰退型，因此，此期的菌種不宜作種子。

微生物中單細(xì)胞生長曲線，反映了一種微生物在某種生活環(huán)境中（試管、搖瓶、發(fā)酵罐）的生長、繁殖和死亡的規(guī)律。研究生長曲線既可為研究營養(yǎng)和環(huán)境條件提供理論依據(jù)，又可用來調(diào)控微生物的生長發(fā)育。

霉菌的生長也有延遲期、穩(wěn)定期和衰亡期。由于它們不是單細(xì)胞微生物，所以它們的繁殖不按幾何級數(shù)增加，故而沒有對數(shù)生長階段。

五、連續(xù)培養(yǎng)

1、分批培養(yǎng)：在培養(yǎng)微生物時。將微生物置于一定容積的定量培養(yǎng)基中培養(yǎng)，稱為定量培養(yǎng)。

2、連續(xù)培養(yǎng)：是在微生物的培養(yǎng)過程中，不斷地供給營養(yǎng)物質(zhì)，并排除老菌液，讓培養(yǎng)的微生物相對地維持較長時間的對數(shù)生長期，以利于提供較多的對數(shù)生長細(xì)胞。在發(fā)酵工業(yè)上，可提高發(fā)酵率和自動化水平，減少動力消耗并提高產(chǎn)品質(zhì)量。有三種方法：

（1）、恒濁連續(xù)培養(yǎng)法；（2）、恒化連續(xù)培養(yǎng)法。

連續(xù)培養(yǎng)法在工業(yè)生產(chǎn)上稱為連續(xù)發(fā)酵。我國在丙酮、丁醇、酒精的生產(chǎn)以及檸檬酸的發(fā)酵上已采取了連續(xù)發(fā)酵法，縮短了發(fā)酵周期，效果良好。連續(xù)發(fā)酵的最大優(yōu)點是取消了分批發(fā)酵中各批之間的間斷時間，縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率。再者，連續(xù)發(fā)酵便于工業(yè)生產(chǎn)，自動化控制，產(chǎn)物均一，產(chǎn)量高。但是在工業(yè)化生產(chǎn)中連續(xù)發(fā)酵容易發(fā)生雜菌污染及菌種退化等問題。

第三節(jié)

環(huán)境條件對微生物的影響

外界環(huán)境對微生物的作用有三種情況：

（1）、外界環(huán)境條件適宜時，微生物生長旺盛，代謝作用加速；（2）、外界環(huán)境條件不太適宜時，微生物生長緩慢，代謝作用受到一定程度的抑制；

（3）、外界環(huán)境不適宜的情況達到微生物難以忍受的程度，這時，微生物生命活動受到嚴(yán)重的影響，可能發(fā)生變異或死亡。

人們控制和調(diào)節(jié)微生物所處的環(huán)境條件的目的是要促進某些有益微生物的生長，發(fā)揮它們的有益作用；抑制和殺死那些不利于人類的微生物，并清除它們的有害作用，如防止食品的腐敗變質(zhì)等。

了解以下常用的幾個概念；

（1）、防腐（Antisepsis）：又叫抑菌，是防止或抑制微生物的生長繁殖。（2）、消毒（Disinfection）：是指殺死病原微生物的措施。

（3）、滅菌（Sterilization）：殺滅物體上所有的微生物，包括病原微生物及非病原微生物。

（4）、商業(yè)滅菌：是從商品的需要出發(fā)對食品進行的滅菌，指食品經(jīng)過殺菌處理后，按一定的檢驗方法檢不出活的微生物或者僅能檢出極少數(shù)的非病原微生物，而且，它們在一定的保存期內(nèi)不至于引起食品變質(zhì)腐敗。

（5）、無菌（Asepsis）：即無活的微生物存在。如無菌操作。

（6）、死亡（dead）：是指微生物不可逆的喪失了生長繁殖的能力，即使再放到合適的環(huán)境中也不再繁殖。

環(huán)境因素包括：物理條件、化學(xué)條件和生物條件

一、溫度

溫度是影響生物機體的最重要的因素之一。溫度的變化影響著微生物的細(xì)胞中生化反應(yīng)速度。

熱力致死時間（Thermal Death Time TDT）：是指在特定的條件和特定的溫度下，殺死一定數(shù)量微生物所需要的時間。

D值（Decimal reduction time）在一定溫度下加熱，活菌數(shù)減少一個對數(shù)周期（即90％的活菌被殺死）時，所需要的時間（min）。

Z值：如果在加熱至死曲線中，時間降低一個對數(shù)周期（即縮短90％的加熱時間）所需要升高的溫度（oC）。

F值：在一定的基質(zhì)中，其溫度為121.1 oC，加熱殺死一定數(shù)量微生物所需要的時間（min）。

高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌。

（一）、干熱滅菌（diy heat sterilization）

主要用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。

1、火焰滅菌：直接利用火焰燃燒殺滅微生物。該方法滅菌迅速、徹底。

2、加熱空氣滅菌：將空氣加熱達140-160oC，保持1-2h。

（二）、濕熱滅菌（moist heat sterilization）

1、煮沸滅菌：煮沸溫度接近100 oC，保持15-30min，可殺死微生物的營養(yǎng)體，若要殺死芽孢，則需要2-3h，此法適用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。

2、間歇滅菌（vfractional sterillization或tyndallization）：用蒸汽加熱滅菌溫度不超過100 oC，每日一次，每次加熱30min，連續(xù)三次。

3、巴氏消毒（pasteurization）：有些食品或物品在高溫下會受到不同程度的損害，不宜用過高的溫度滅菌，可采用較低的溫度進行滅菌，條件是62-63 oC，30min；或72 oC，15s。適用于殺死食品中的病原菌。

4、高壓蒸汽滅菌（normal autoclaving）：1kg/cm2，121.5 oC，15-30min。

5、超高溫瞬時殺菌法（Ultra high temperature short time，UHT）：滅菌溫度132-150 oC，3-5s，可殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和耐熱性強的芽孢細(xì)菌，但污染嚴(yán)重的鮮乳在142 oC以上殺菌效果才好。

二、濕度

干燥能引起微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性和鹽濃度增高，這是抑制微生物生長或促進其死亡的主要原因。

三、滲透壓

嗜鹽微生物、嗜糖微生物的概念。

除以上耐高滲微生物之外，一般來說，18%-25%的鹽濃度能完全阻止微生物的生長。

由于高滲透壓對微生物有抑制作用，所以，在食品工業(yè)上，廣泛地利用腌制和糖漬方法來保存食品。

四、氧化還原電位

不同的微生物需要的氧化還原電位不同。

五、輻射

1、紫外線：細(xì)胞中的核酸具有吸收紫外線的性能，紫外線的輻射能量作用于核酸時，能引起核酸的變化。妨礙蛋白質(zhì)和酶的合成。紫外線殺菌作用常用于空氣消毒和器材物體表面消毒。

2、x、γ射線：x射線不如γ射線，γ射線被空氣吸收較少，射程遠(yuǎn)，穿透力強，可用于食品殺菌。

由于各種射線照射殺菌時不需要高溫，所以這類殺菌又稱為冷殺菌。

六、超聲波與微波

超聲波對微生物細(xì)胞內(nèi)含物有強烈的震蕩作用，可破壞細(xì)胞，另外，水溶液經(jīng)處理后能產(chǎn)生過氧化氫，因而有殺菌能力，可以用來保藏食品。

微波是利用熱效應(yīng)對微生物有殺滅作用。微波產(chǎn)生熱效應(yīng)的特點是加熱均勻，熱能利用效率高，加熱時間短。目前微波用于食品滅菌。

七、氫離子濃度

pH值對微生物生長影響較大，主要影響菌體細(xì)胞膜上的電荷，影響物質(zhì)的吸收、代謝。每種微生物都有自己適宜的pH值范圍。超過此一定范圍后，生長就會停止。由于pH值不同會影響微生物的代謝活動，改變物質(zhì)合成方向。

高濃度氫離子可引起菌體表面蛋白質(zhì)和核酸的水解，破壞酶的活性。另外，某些有機酸可引起氧化作用，具有殺菌作用。如食品防腐劑苯甲酸和水楊酸等。高濃度的堿具有殺菌作用，如石灰水、氫氧化鈉、碳酸鈉等作為機器、工具以及冷庫等的消毒劑。

八、化學(xué)物質(zhì)

（一）、氧化劑：氧化劑殺菌的效果與作用和濃度成正比關(guān)系，殺菌的機理是氧化劑放出游離氧作用于微生物蛋白質(zhì)的活性基團（氨基、羥基和其他化學(xué)基團），造成代謝障礙而死亡。主要有高錳酸鉀、過氧化氫、漂白粉、過氧乙酸、碘等。

（二）、甲醛：殺菌機理是與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合而使蛋白質(zhì)變性至死。

（三）、酚類：機理是蛋白質(zhì)變性。石炭酸（苯酚）、來蘇兒。

（四）、醇類：脫水劑，乙醇：70%的乙醇?xì)⒕芰ψ顝姟?/p>

（五）、新潔爾滅

（六）、毒性物質(zhì)：SO2、H2S、CO、CN-。

（七）、染料：結(jié)晶紫、孔雀綠、復(fù)紅、次甲基藍(lán)、孟加拉紅對微生物有抑制作用。

（八）、重金屬鹽類：重金屬鹽類對微生物都有毒害作用，其機理是金屬離子容易和微生物的蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)生變形或沉淀。

第二篇：微生物的生長與環(huán)境條件答案

第六章

微生物的生長與環(huán)境條件答案

一、選擇題 60975.D

60976.B 60977.B 60978.A 60979.B 60980.A 60981.B 60982.B 60983.A 60984.A 60985.B 60986.B 60987.B 60988.C 60989.B

二、判斷題 60990.對 60991.錯 60992.錯 60993.錯 60994.錯 60995.錯 60996.對 60997.錯 60998.錯 60999.錯 61000.錯 61001.對 61002.對 61003.對 61004.對 61005.對

三、填空題

61006.專 性 嗜 冷, 兼 性 嗜 冷。61007.室 溫 , 體 溫。61008.6.5-7.5。61009.7.5-8。61010.5-6。

61011.98kpa, 121。C, 30min。61012.真 菌 和 放 線 菌。61013.代 時。61014.中。

61015.前 者 殺 死 微 生 物 的 營 養(yǎng) 體，后 者 殺 死 所 有 微 生 物 的 細(xì) 胞，細(xì) 菌 的 芽 胞。

61016.高 溫 殺 菌，化 學(xué) 殺 菌，幅 射 殺 菌。61017.低 溫 型，中 溫 型，高 溫 型。61018.慢，冰 凍。

61019.孢 子，菌 種 干 燥 保 藏。61020.烘 干，曬 干，熏 干。61021.不 同。

61022.70%，2-6ml/M3。

61023.發(fā) 生 質(zhì) 壁 分 離，吸 水 膨 脹 甚 至 破 裂。

61024.分 裂 遲 緩，代 謝 活 躍，菌 數(shù) 增 長近于 零。

包 括 61025.細(xì) 菌 數(shù) 以 幾 何 級 數(shù) 增 加。

61026.新 增 殖 的 細(xì) 胞 數(shù) 與 老 細(xì) 胞 的 死 亡 數(shù) 幾 乎 相 等，此 時 活 菌 數(shù) 最

多。

61027.菌 體 的 死 亡 數(shù) 超 過 新 生 數(shù)。

61028.滯 留 適 應(yīng) 期，對 數(shù) 生 長 期，最 高 穩(wěn) 定 生 長 期，衰 亡 期。61029.對 數(shù) 生 長。61030.連 續(xù) 培 養(yǎng) 法。61031.最 高 穩(wěn) 定。61032.好 氧，厭 氧。61033.20-25。

61034.加 大 接 種 量 和 采 用 處 于 對 數(shù) 生 長 期 的 菌 種 接 種。

。61035.62-63C，30min或 71C，15min。61036.常 壓 80-100℃ 處 理 15-60 分 鐘，37℃ 保 溫 培 養(yǎng) 過 夜，再 同 上 蒸 煮，如 此

連 續(xù) 三 天。

61037.5℃，25-37℃，45-50℃。

61038.30 ℃，45-55 ℃，60-75 ℃，溫 泉 和 堆 肥 中。61039.-5-0℃，10-20℃，25-30℃，冷 藏 食 品 上。

61040.-12℃，5-15℃，15-20℃，海 洋 深 處、雪 山 等 地。61041.中 溫 型 的。

61042.中 溫 型 的。

61043.計 數(shù) 板 計 數(shù) 法，涂 片 計 數(shù) 法，比 濁 法。

61044.稀 釋平板 計 數(shù) 法，濾 膜 培 養(yǎng) 法，稀 釋 培 養(yǎng) 法(MPN 法)。61045.化 學(xué) 吸 氧 法，密 閉 容 器 內(nèi) 反 復(fù) 抽 真 空 后 充 N2。61046.10-15℃，25-37℃，45-50℃。61047.恒 濁 法，恒 化 法。

61048.好 氧，兼 性 厭 氧，厭 氧，微 好 氧。61049.乳 酸 菌，乳 酸，腐 生 細(xì) 菌。61050.殺 菌，防 腐。61051.低 溫 防 腐，加 無 毒 的 化 學(xué) 防 腐 劑，干 燥 防 腐，利 用 微 生 物 產(chǎn) 酸 防

腐。

61052.是 細(xì) 胞 的 組 分，是 生 化 反 應(yīng) 的 介 質(zhì)，是 吸 收 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 和 分 泌 代 謝

物 的 良 好 溶 劑，能 有 效 地 控 制 細(xì) 胞 溫 度。

61053.引 起 細(xì) 胞 膜 電 荷 的 變 化，從 而 影 響 微 生 物 對 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 的 吸 收，影 響 代 謝 過 程 中 酶 的 活 性，改 變 環(huán) 境 中 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 的 可 給 性 及 有 害 物 質(zhì) 的 毒 性。

61054.25-30% 61055.丙 酸 鈣

61056.苯 甲 酸 鈉

四．名詞解釋

61057.生 長 是 指 微 生 物 的 細(xì) 胞 組 分 與 結(jié) 構(gòu) 在 量 方 面 的 增 加 過

程。61058.從 生 長 到 繁 殖 是 一 個 量 變 到 質(zhì) 變 的 過 程，這 個 過 程 就 是 發(fā) 育。61059.由 細(xì) 胞 分 裂 而 引 起 的 個 體 數(shù) 目 的 增 加，稱 為 繁 殖。61060.在 有 氧 無 氧 條 件 下 均 能 生 長 的 細(xì) 菌。61061.指 在 空 氣 或 氧 氣 存 在 下 生 長 的 微 生 物。61062.在 沒 有 空 氣 或 氧 氣 條 件 下 生 活 的 微 生 物。

61063.經(jīng) 過 反 復(fù) 分 離 純 化 后，在平板 上 挑 取 的 由 單 個 菌 落 繁 衍 的 微

生 物 后 代。

61064.單 個 細(xì) 胞 完 成 一 次 分 裂 所 需 的 時 間。

61065.當(dāng) 細(xì) 菌 在 適 宜 的 環(huán) 境 條 件 下 培 養(yǎng) 時，如 果 以 培 養(yǎng) 的 時 間 為 橫

座 標(biāo)，以 細(xì) 菌 數(shù) 量 變 化 為 縱 坐 標(biāo)，根 據(jù) 細(xì) 菌 數(shù) 量 變 化 與 相 應(yīng) 時 間 變 化 之 間 的 關(guān) 系，可 以 作 出 一 條 反 應(yīng) 細(xì) 菌 在 培 養(yǎng) 期

間 菌 數(shù) 變 化 規(guī) 律 的 曲 線，這 種 曲 線 稱 為 生 長 曲 線。

61066.在 一 定 條 件 下(如 10 分 鐘)，殺 死 某 種 微 生 物 的 最 低 溫 度。61067.在 一 定 條 件 下(如 60℃)殺 死 微 生 物 所 需 要 的 最 短 時 間。

61068.將 微 生 物 置 于 一 定 容 積 的 培 養(yǎng) 基 中，經(jīng) 過 培 養(yǎng) 生 長，最 后

一

次 收 獲，此 稱 為 分 批 培 養(yǎng)。

61069.細(xì) 菌 純 培 養(yǎng) 生 長 曲 線 表 明，細(xì) 菌 培 養(yǎng) 物 的 最 高 得 率 在 對 數(shù) 生

長 期。通 過 控 制 環(huán) 境 條 件，使 細(xì) 菌 的 生 長 始 終 保 持 在 對 數(shù) 生 長 期，從 而 可 以 獲 得 更 多 的 細(xì) 菌 培 養(yǎng) 物，這 種 方 法 稱 為 連 續(xù)

培 養(yǎng)。

61070.指 能 在 氧 分 壓 低 于 正 常 大 氣 環(huán) 境 中 表 現(xiàn) 最 大 生 長 速 度 的 細(xì)

菌。

61071.在 分 子 氧 存 在 下 也 能 生 活 的 厭 氧 菌。

61072.二 元 培 養(yǎng) 是 純 培 養(yǎng) 的 一 種 特 殊 形 式。有 些 寄 生 微 生 物 只 能 在

寄 生 微 生 物 體 內(nèi) 寄 生，必 須 將 寄 生 微 生 物 和 寄 主 微 生 物 培 養(yǎng) 在 一 起，同 時 排 除 其 它 雜 菌。例 如 培 養(yǎng) 蘇 云 金 桿 菌 及 其 噬 菌 體，需 先 在平板 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) 蘇 云 金 桿 菌 的 細(xì) 菌 坪，然 后 在 細(xì) 菌 坪 上

接 種 蘇 云 金 桿 菌 的 噬 菌 體，經(jīng) 培 養(yǎng) 后，在 蘇 云 金 桿 菌 的 細(xì) 菌 坪 上 出 現(xiàn) 噬 菌 體 感 染 的 透

明 空 斑，這 種 培 養(yǎng) 方 法 稱 為 二 元 培 養(yǎng)。

61073.在 15% 以 上 鹽 濃 度 下 才 能 生 長，最 適 生 長 的 鹽 濃 度 為 25-30% 的

嗜 鹽 菌 稱 為 極 端 嗜 鹽 菌。

61074.采 用 物 理 或 者 化 學(xué) 的 方 法 使 微 生 物 處 于 比 較 一 致 的 生 長 發(fā) 育

階 段 上 的 培

養(yǎng) 方 法 叫 同 步 培 養(yǎng)。例 如 利 用 孔 徑 大 小 不 同 的 濾 膜，將 大 小 不 同 的 細(xì) 胞 分 開 培

養(yǎng)，可 使 同 一 大 小 的 細(xì) 胞 處 于 同 一 生 長 階 段。

五．問答題

61075.溫 度 對 微 生 物 的 影 響 可 概 括 為： 適 宜 的 溫 度 有 利 于 微 生 物 的 生 長 高 溫 可 使 菌 體 蛋 白 變 性，導(dǎo) 致 微 生 物 死 亡，常 用 高 溫 進行 消 毒 滅 菌低 溫 對 微 生 物 具 有 抑 制 或 殺 傷 作 用，故 低 溫 用 于 保 藏 食 品

61076.秋 天 之 所 以 容 易 栽 培平菇 是 因 為： 秋 冬 病 蟲 害 少平菇 子 實 體 形 成 溫 度 比 菌 絲 生 長 溫 度 要 低，當(dāng) 菇 床 菌 絲 長 滿 以 后，適 當(dāng) 降 溫，(秋 冬 天 降 溫 容 易)，有 利 于平菇 子 實 體 的 形 成。

61077.細(xì) 菌 的 純 培 養(yǎng) 生 長 曲 線 分 為 四 個 時 期，即 滯 留 期，對 數(shù) 生 長 期，最 高 穩(wěn) 定 生 長 期 和 衰 亡 期。

滯 留 期 的 特 點 是： 分 裂 遲 緩，代 謝 活 躍。

對 數(shù) 生 長 期 的 特 點 是： 細(xì) 菌 數(shù) 量 以 幾 何 級 數(shù) 增 加。

最 高 穩(wěn) 定 生 長 期 的 特 點 是： 新 增 殖 的 細(xì) 胞 數(shù) 與 老 細(xì) 胞 的 死 亡 數(shù) 幾 乎 相 等。

衰 亡 期 的 特 點 是； 活 菌 數(shù) 按 幾 何 級 數(shù) 下 降。

61078.滅 菌 是 殺 死 所 有 微 生 物

消 毒 是 殺 死 或 消 除 所 有 病 原 微 生 物，達 到 防 止 病 原 菌 傳 播 的 目的 防 腐 是 利 用 理 化 因 子 使 微 生 物 暫 不 生 長

化 療 是 有 效 地 消 除 宿 主 體 內(nèi) 的 微 生 物

61079.取 載 玻 片 一 塊，用 蠟 筆 在 中 央 畫 出 一平方 厘 米 的 面 積。將 待 測

樣 品 稀 釋 到 一 定 濃 度 后 取 0.01 毫 升 菌 液 滴 在 載 玻 片 上 的 一平方 厘 米 面 積 上。然 后 在 顯 微 鏡 下

計 數(shù) 每 個 視 野 的 菌 數(shù)(至 少 數(shù) 10 個 視 野，計 算平均 菌 數(shù))。將 視 野 的 面 積 算 出 來

后，按 下 列 公 式 計 算 樣 品 中 的 含 菌 數(shù)。

平方 厘 米

每克樣品中的含菌數(shù) ＝--------------------? 每個視野的平均菌數(shù)?100?稀釋倍數(shù)

視 野 面 積

61080.干 重 法 主 要 用 來 測 發(fā) 酵 液 中 絲 狀 真 菌 或 放 線 菌 的 生 長 量。

取 一 定 量 的 發(fā) 酵 液(如 100 毫 升)過 濾 后 連 同 濾 紙 一 道 烘 干 至 恒 重 后 稱 重，然 后 再 減 去 濾 紙 的 干 重，即 為 100 毫 升 發(fā) 酵 液 中 某 種 微 生 物 干 物 質(zhì) 的 量。

61081.為 了 防 止 微 生 物 在 培 養(yǎng) 過 程 中 因 自 身 的 代 謝 作 用 產(chǎn) 酸 或 產(chǎn) 堿

改 變 環(huán) 境 的 pH 值，通 常 在 配 制 培 養(yǎng) 基 時 預(yù) 先 加 入 緩 沖 物 質(zhì) 如 磷 酸 鹽 或 碳 酸 鈣。

61082.用 比 濁 法 測 定 微 生 物 的 數(shù) 量 主 要 是 在 工 業(yè) 生 產(chǎn) 中 采 用，它 的

特 點 是 快 速。

在 測 定 前 首 先 必 需 繪 制 出 濁 度 與 數(shù) 量 的 相 關(guān) 曲 線，濁 度 用 光 電 比 色 計 測 定，菌 數(shù) 靠 用 稀 釋平板 法 測 定 或 用 計 數(shù) 板 測 定。曲 線 繪 好 后，在 生 產(chǎn) 中，只 要 用 比 色

計 測 出 菌 液 的 任 一 濁 度 后 就 可 以 從 曲 線 上 查 出 相 應(yīng) 的 菌 數(shù)。

61083.在 t0時 菌 數(shù) X=100

在 t1 時 菌 數(shù) Y=1000000000

92n(代 數(shù))=3.3lg(y/x)= 3.3(lg100)÷23.1 = 17.3

在 上 述 培 養(yǎng) 中，該 菌 的 代 時 為 17.3 分 鐘，400 分 鐘 內(nèi) 共 繁 殖 了23.1代。

61084.原 因 有 三 條：

蛋 白 質(zhì) 在 有 水 的 條 件 下 變 性 溫 度 比 無 水 時 的 變 性 溫 度 要 低。水 蒸 汽 的 穿 透 力 比 熱 空 氣 的 穿 透 力 強。

水 蒸 汽 有 潛 熱。

第三篇：微生物的生長 教案

微生物的生長

教案

第二節(jié)《微生物的營養(yǎng)、代謝和生長》-微生物的生長

教學(xué)設(shè)計

【教學(xué)目標(biāo)】

知識目標(biāo)

1、微生物群體生長的規(guī)律及其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用（理解）。

2、測定微生物群體生長的方法（識記）。

3、度、pH和氧等因素對微生物生長的影響（理解）。

能力目標(biāo)

1.通過細(xì)菌生長曲線的學(xué)習(xí)，提高學(xué)生的的圖表對比分析能力。

2.通過細(xì)菌生長曲線與種群生長曲線的對比，培養(yǎng)學(xué)生歸納與演繹的能力。

情感態(tài)度與價值觀

通過微生物的一般生長規(guī)律與種群的生長規(guī)律的對比，培養(yǎng)學(xué)生正確看待一般問題與特殊問題，個性與共性的關(guān)系?！窘虒W(xué)重點】

（1）微生物群體生長的規(guī)律及其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用。

（2）溫度、pH和氧等因素對微生物生長的影響。【教學(xué)難點】

微生物群體生長的規(guī)律及其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用。

教學(xué)設(shè)計

【導(dǎo)入新課】

前面，我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了微生物的營養(yǎng)與代謝，知道了微生物需要不斷從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)，通過代謝，獲取能量并合成自身的組成物質(zhì)，以維持自身正常的生命活動。那么，從代謝的角度來看，當(dāng)同化作用大于異化作用時，微生物將表現(xiàn)出怎樣的特征？

學(xué)生回答：生長的現(xiàn)象。

那么什么是微生物的生長呢，我們一般是如何來研究微生物的生長的呢？

這就是本節(jié)課我們所要學(xué)習(xí)的內(nèi)容——微生物的生長?！就七M新課】

微生物的生長包括微生物細(xì)胞體積的擴大與細(xì)胞數(shù)目的增多，由于大多數(shù)微生物細(xì)胞體積較小，個體質(zhì)量較輕，微生物的個體生長不易觀察；同時由于微生物繁殖速度一般較快，因而通常以微生物的群體為單位來研究微生物的生長。

那么，微生物的群體生長會具有怎樣的特征呢？群體生長狀況是否具有一定的規(guī)律？假如有的話，這是怎樣一種規(guī)律？研究這一規(guī)律具有怎樣的現(xiàn)實意義呢？接下來我們一起來學(xué)習(xí)

學(xué)習(xí)目標(biāo)一：微生物群體生長規(guī)律

教師分析：由于在自然環(huán)境下微生物群體生長受到非生物影響、種內(nèi)關(guān)系、種間關(guān)系等多種因素的綜合影響其群體生長的狀況多變而復(fù)雜，往往難以描述，因而，從實際工作的角度出發(fā)，微生物的群體生長狀況的研究一般是置于人工控制的條件下進行的。那么，我們?nèi)绾蝸砻枋?細(xì)菌的生長曲線呢？

師生共同總結(jié)：從細(xì)菌接種到培養(yǎng)基中開始到培養(yǎng)基中的細(xì)菌群體死亡的動態(tài)變化，可以分為調(diào)整期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個重要時期。

教師強調(diào)：微生物的群體生長曲線是種群內(nèi)個體生長的一個頻率統(tǒng)計，反應(yīng)的是微生物種群概念上的數(shù)量變化特征，因而并非是該時期的所有個體均具有相應(yīng)的特征。

教師設(shè)置問題情景，引導(dǎo)學(xué)生思考：細(xì)菌生長曲線是運用數(shù)學(xué)模型研究群體生長規(guī)律的一種方法。那么，我們一般是按怎樣的標(biāo)準(zhǔn)來劃分各區(qū)段的？具體而言，不同區(qū)段究竟蘊涵了怎樣的生物學(xué)含義呢？

師生互動，教師利用投影，呈示下述表格，使學(xué)生明確需要研究的問題。

（1）調(diào)整期

細(xì)菌剛被接種到培養(yǎng)基上時，對新環(huán)境有一個短暫的調(diào)整或適應(yīng)的過程，一般不立即進行分離的情景，同時反映細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)等特征，教師對調(diào)整期的時間、群體生長速率、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特征、實踐意義等方面的問題總結(jié)如下：

①時間：從細(xì)菌剛被接種到培養(yǎng)基上開始，到細(xì)菌開始進入快速分裂為止。②生長速率：幾乎為零，細(xì)胞數(shù)目幾乎不變。③細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)：細(xì)菌細(xì)胞體積增長較快。

④細(xì)胞的生理特點：細(xì)菌代謝活躍，是合成初級代謝產(chǎn)物量最多的時期；細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)大量合成細(xì)胞分裂所需的酶、ATP及其他細(xì)胞成分，為下一階段的細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備。

⑤影響該階段長短的相關(guān)因素：

Ⅰ菌種：若把對數(shù)期的菌種接種到培養(yǎng)基上時，可相對縮短調(diào)整期；若把穩(wěn)定期或其他時期的菌種接種到培養(yǎng)基上時，則調(diào)整期相對較長。

Ⅱ培養(yǎng)基：若培養(yǎng)基的理化性質(zhì)與原先菌種的培養(yǎng)基比較相似，則調(diào)整期時間較短；若培養(yǎng)基的理化性質(zhì)與原先菌種的培養(yǎng)基相差比較大，則調(diào)整期時間較長。

（2）對數(shù)期

學(xué)生分析觀察、討論： ①時間

教師提問：我們一般把哪一個階段稱為細(xì)菌群體生長的對數(shù)期呢？

學(xué)生回答：從細(xì)菌開始快速分裂開始，到培養(yǎng)基中細(xì)菌的群體數(shù)目不再增加，保持動態(tài)穩(wěn)定為止。

②生長速率

教師提問：在細(xì)菌群體生長的對數(shù)期階段，群體生長速率具有怎樣的特征？ 學(xué)生回答：速率最快，細(xì)胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加；可以用Bn總=Bn×2來描述。③細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu) 教師提問：那么，大多數(shù)細(xì)菌的細(xì)胞在這一階段具有怎樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特征呢？

學(xué)生回答：形態(tài)特征最為穩(wěn)定，細(xì)菌生理特征比較穩(wěn)定，代謝旺盛，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)各種組分，特別是核糖體數(shù)量劇增，此階段的代謝容易受到周圍環(huán)境條件的影響。

④影響階段長短的相關(guān)因素

教師提問：影響這一階段時間長短的相關(guān)因素有哪些呢？ 學(xué)生主要從以下幾方面展開討論： Ⅰ菌種：該種細(xì)菌的遺傳特性；

Ⅱ培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的各種理化性質(zhì)（如培養(yǎng)基化學(xué)成分與PH、T、氧氣）是否適宜； Ⅲ溫度：溫度通過影響酶活性來影響微生物的新陳代謝速率，從而影響對數(shù)期的長短。

⑤造成該階段特征的主要原因 學(xué)生討論：略。

教師提問：從生態(tài)學(xué)角度來看，造成細(xì)菌群體生長的對數(shù)期的主要原因有哪些呢？ 學(xué)生討論：略。

總結(jié)：培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充分，空間充裕，種內(nèi)斗爭不劇烈；培養(yǎng)基中的PH、T、氧氣等條件適宜，微生物新陳代謝旺盛，能量供應(yīng)充足，培養(yǎng)基中一些有害的代謝產(chǎn)物尚未開始積累；微生物種群的出生率大于死亡率，種群密度增加。

⑥實踐意義

教師講述：這一階段在生產(chǎn)實踐上具有相當(dāng)重要的意義，例如控制對數(shù)期。那么，為何要在生產(chǎn)過程中根據(jù)生產(chǎn)實際需要，控制微生物群體生長的對數(shù)期呢？

學(xué)生討論：略。

教師分析：以酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生酒精而言，如果對數(shù)期過長，營養(yǎng)物質(zhì)量消耗過多，會導(dǎo)致下一個階段微生物積累的代謝產(chǎn)物減少；如果對數(shù)期過短，培養(yǎng)基中的菌體數(shù)目比較少，也會導(dǎo)致下一個階段微生物積累的代謝產(chǎn)物減少。

（3）穩(wěn)定期

學(xué)生通過對信息的觀察、分析與討論，對穩(wěn)定期的時間、群體生長速率、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特征等方面的問題總結(jié)如下：

①時間：從培養(yǎng)基中細(xì)菌的群體數(shù)目不再增加，保持動態(tài)穩(wěn)定開始，到培養(yǎng)基中細(xì)菌群體數(shù)目開始減少為止。②生長速率：分裂速率相對對數(shù)期下降，死亡速率上升，細(xì)胞數(shù)目動態(tài)平衡，活細(xì)菌數(shù)目達到最高峰。

③細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)：某些產(chǎn)芽孢細(xì)菌在這個時期開始產(chǎn)生芽孢。

細(xì)胞的生理特點：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)開始大量積累代謝產(chǎn)物，特別是次級代謝產(chǎn)物。④影響該階段長短的相關(guān)因素：菌種、培養(yǎng)基理化性質(zhì)、溫度等因素。⑤造成原因：

Ⅰ培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)在對數(shù)期被大量消耗，同時由于培養(yǎng)基中細(xì)菌的種群數(shù)目達到最你 大，種內(nèi)斗爭劇烈，導(dǎo)致個體死亡率上升，出生率下降。

Ⅱ因為微生物長時間代謝，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的PH、T、氧氣等理化性質(zhì)發(fā)生改變，微生物新陳代謝速率下降，能量供應(yīng)不足，細(xì)菌細(xì)胞生長、分裂速度下降。

Ⅲ培養(yǎng)基中一些有害的代謝產(chǎn)物開始積累，影響微生物生長。⑥實踐意義——延長穩(wěn)定期：

教師提問：為什么延長穩(wěn)定期可以提高發(fā)酵工程的產(chǎn)量呢？生產(chǎn)中該如何來進行合理控制，以延長穩(wěn)定期呢？

學(xué)生小組討論后，總結(jié)：Ⅰ進入穩(wěn)定期以后，包括抗生素在內(nèi)的多種次級代謝產(chǎn)物開始大量積累，如果適時補充營養(yǎng)物質(zhì)，排出有害的代謝產(chǎn)物，則可延長穩(wěn)定期，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ⅱ延長穩(wěn)定期的方法有很多，其中微生物的連續(xù)培養(yǎng)是一種比較常用的辦法。

在穩(wěn)定期后，細(xì)菌群體生長將進入什么時期呢？（4）衰亡期

教師提問：什么叫衰亡期？

學(xué)生回答：在穩(wěn)定期之后，隨著培養(yǎng)的繼續(xù)進行，細(xì)菌群體的死亡速率大于繁殖速率，培養(yǎng)基中細(xì)菌群體的數(shù)目開始急劇下降，這一階段稱為衰亡期。

教師提問：該時期的微生物群體、微生物細(xì)胞個體有怎樣的特點？在生產(chǎn)實踐中有何應(yīng)用價值？

學(xué)生總結(jié)：

時間：從培養(yǎng)基中細(xì)菌的群體數(shù)據(jù)急劇減少開始，到培養(yǎng)基中細(xì)菌種群消亡為止。生長速率：死亡速率超過繁殖速率，導(dǎo)致培養(yǎng)基中細(xì)菌群體的活細(xì)胞數(shù)目不斷下降。細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)：細(xì)胞出現(xiàn)了多種形態(tài)，甚至畸形。細(xì)胞的生理特點：有些細(xì)菌開始解體，釋放出代謝產(chǎn)物。影響該階段長短的相關(guān)因素：1菌種：產(chǎn)芽孢的細(xì)菌其芽孢比代謝活躍的營養(yǎng)細(xì)胞更易于存活。2培養(yǎng)基梨花性質(zhì)、溫度等因素

造成該階段特征的原因：1.培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)進一步被大量消耗，同時由于培養(yǎng)基中細(xì)菌的種內(nèi)斗爭進一步加劇，導(dǎo)致個體死亡率急劇上升，出生率急劇下降。

2.因為微生物長時間代謝，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的PH、T、氧氣等理化性質(zhì)發(fā)生改變，微生物

微生物新陳代謝速率下降，能量供應(yīng)不足，細(xì)菌細(xì)胞生長、分裂速度下降 3.隨著部分細(xì)菌細(xì)胞的裂解，培養(yǎng)基中一些有害的代謝產(chǎn)物大量累積，影響微生物生長。

實踐意義：延長衰亡期

通過補充營養(yǎng)和能源、中和環(huán)境毒性，可以減緩細(xì)胞死亡速率，延長細(xì)菌群體的存活時間。

學(xué)習(xí)目標(biāo)二：微生物群體生長規(guī)律的應(yīng)用

1.酒精生產(chǎn)中，設(shè)法縮短調(diào)整期，控制對數(shù)期，以便在短時間內(nèi)獲得最大的產(chǎn)量。2.醫(yī)學(xué)上，要通過細(xì)菌染色來鑒定細(xì)菌，通常采用對數(shù)期的菌體，因為這一階段的細(xì)菌細(xì)胞生理特征最穩(wěn)定

3.工業(yè)上產(chǎn)生酵母，通常在穩(wěn)定期收集菌體，因為這一時期菌體數(shù)目最大。學(xué)習(xí)目標(biāo)三：影響微生物生長的環(huán)境因素 1．溫度：

微生物生長最旺盛時的溫度叫最適生長溫度。

在最適生長溫度范圍內(nèi)，微生物的生長速率隨溫度的上升而加快；超過最適生長溫度后，微生物的生長速率會急劇下降，這是由于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生了不可逆的破壞。2．pH：

超過最適pH范圍以后，會影響酶的活性、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性等，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。多數(shù)細(xì)菌的最適pH為6.5～7.5，真菌的最適pH為5.0～6.0。3．氧：

環(huán)境中氧含量的狀況，對不同代謝類型的微生物群體的生長，具有不同的影響。按照微生物對氧含量的要求可分為好氧型微生物、厭氧型微生物和兼性厭氧微生物。【反饋練習(xí)】

1．(2004廣東生物)將少量的某種細(xì)菌接種到恒定容積的液體培養(yǎng)基中，并置于適宜的條件下培養(yǎng)，定期取樣統(tǒng)計細(xì)菌的數(shù)目。如果以時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，可以得到細(xì)菌的生長曲線。曲線中，細(xì)菌數(shù)量變化較大的時期為（）A．衰亡期和調(diào)整期 B．調(diào)整期和穩(wěn)定期 C．對數(shù)期和衰亡期 D．穩(wěn)定期和對數(shù)期

2、（2005北京春理綜）將酵母分為a、b、c、d四組，用不同的方式培養(yǎng)，其種群增長曲線如圖所示。請據(jù)圖回答下列問題。

（1）a呈現(xiàn)____型增長，該種群的生長在20h之前處于____期，20h－40h處于_____期。（2）d呈現(xiàn)_______型增長，在100h－200h，d的增長率趨于______________。若在現(xiàn)有條件下繼續(xù)培養(yǎng)，其種群數(shù)量趨于____________。（A增多 B減少）

（3）隨著更換培養(yǎng)液的時間間隔的延長，酵母種群的增長率趨于_________，其可能的限制因素是________不足和__________的積累。

【答案】（1）J 調(diào)整 對數(shù)

（2）S 0（或零）B（或減?。?/p>

（3）降低（或減小）營養(yǎng)

有害代謝產(chǎn)物（或有害產(chǎn)物）【板書設(shè)計】

第二節(jié) 微生物的生長

一、微生物的的群體生長規(guī)律

1.調(diào)整期 2.對數(shù)期 3.穩(wěn)定期 4.衰亡期

二、微生物群體生長規(guī)律的應(yīng)用

三、影響微生物生長的環(huán)境因素

1.溫度 2.PH 3.氧

第四篇：第六章微生物的生長與環(huán)境條件試題

第六章微生物的生長與環(huán)境條件試題

一、選擇題

60975.高溫對微生物的致死是因為：

A高溫使菌體蛋白變性。B高溫使核酸變性。

C高溫破壞細(xì)胞膜的透性。DA-C。答：()60976.光波殺菌最強的波長范圍是: A0.06-13.6nm。B250-280nm。C300-400nm。答:()60977.消毒效果最好的乙醇濃度為: A50%。B70%。C90%。答:()60978.巴氏滅菌的工藝條件是: A62-63℃30min。B71-72℃30min。C60-70℃30min。答：()60979.殺死所有微生物的方法稱為: A消毒。B滅菌。C防腐。答：()60980.測微生物活菌數(shù)通常采用：

A稀釋平板法。B濾膜培養(yǎng)法。C稀釋培養(yǎng)法。答：()60981.測空氣中微生物數(shù)量的方法通常采用：A稀釋平板法。B濾膜培養(yǎng)法。C稀釋培養(yǎng)法。答：()60982.測土壤微生物的總數(shù)常采用：

A.血球板計數(shù)法。B.涂片計數(shù)法。C.比濁計數(shù)法。答：()60983.各種中溫型微生物生長的最適溫度為：A20－40℃。B25－37℃。C35－40℃。答：()60984.好氧微生物生長的最適氧化還原電位通常為： A0.3-0.4V。

B+0.1V以上。C-0.1V以上。答:()

60985.黑曲霉在pH2-3的環(huán)境下發(fā)酵蔗糖:

A主要積累草酸。B主要積累檸檬酸。C主要積累乙酸。答:()

60986.升汞用于實驗室非金屬器皿表面消毒的濃度通常為: A0.001%。B0.1%。C1%。答:()

60987.防腐的鹽濃度通常為:

A5-10%。B10-15%。C15-20%。答:()

60988.鏈霉素抑菌機制是:

A破壞膜的結(jié)構(gòu)。B阻礙細(xì)胞壁的合成。

C阻礙70S核糖體對蛋白質(zhì)的合成。答:()

60989.絲裂霉素的作用機制是:

A阻礙蛋白質(zhì)的合成。B阻礙核酸解鏈。C切斷DNA鏈。答:()

二、判斷題

60990.在10分鐘內(nèi)殺死某微生物的最低溫度

稱為該微生物的致死溫度。答：()

60991.食用菌子實體的形成溫度比菌絲生長

溫度要高，故冬天栽培食用菌要用薄膜復(fù)蓋。答：()

60992.連續(xù)培養(yǎng)的目的是使微生物始終保持

在最高穩(wěn)定生長階段。答：()

60993.酒精的濃度越高，殺菌能力越強。

答：()

60994.微生物生長的最適pH與合成某種代謝

產(chǎn)物的pH是一致的。答：()

60995.0.1%升汞可用于各種金屬器皿的消毒。答：()

60996.黑曲霉菌絲生長溫度比產(chǎn)酶溫度要高。答：()

60997.丙酸、鹽酸都可用作防腐劑。

答：()

60998.由于分子量越大的物質(zhì)產(chǎn)生的滲透壓

越高，所以罐藏食品通常用50-70%的 糖溶液。答：()60999.青霉素因為能阻止G+細(xì)菌肽聚糖的形成，所以也能抑制產(chǎn)甲烷菌的生長。答：()61000.同種微生物菌體生長的最適溫度與積累代謝產(chǎn)物的最適生長溫度是相同的。答：()61001.同一種微生物由于環(huán)境中的PH不同可能積累不同的代謝產(chǎn)物。答：()61002.細(xì)胞大小相同的同種微生物可用來進行同步培養(yǎng)。答：()61003.在培養(yǎng)根瘤菌時常加二十萬分之一的結(jié)晶紫抑制G+細(xì)菌的生長。答：()61004.專性厭氧微生物(如產(chǎn)甲烷菌)生長的最適Eh值通常為-0.3至-0.4V。答：()61005.丙酮丁醇梭菌積累丙酮丁醇的最適pH是4.3-5.3。答：()

三、填空題

61006.低溫型的微生物又可分為_______________型和____________型。

61007.中溫型微生物又可分為____________型和____________型兩類。

61008.多數(shù)細(xì)菌生長最適pH是_______________。

61009.放線菌生長最適pH一般是______________。

61010.真菌生長的最適pH一般是________________。

61011.高壓蒸汽滅菌法常用的工藝條件是：壓力_______________,溫度____________,時間____________。

61012.__________________生長量的測定常用干重法。

61013.指數(shù)生長的速率常以___________來表示。

61014.人和溫血動物的病源菌一般是_____________溫型的。

61015.消毒和滅菌的區(qū)別是___________________________________________。

61016.常消毒方法有_____________，_____________，______________等。61017.微生物按其生長溫度范圍可分為_______、______和_____3類。

61018.溫度愈低，食物腐敗愈__________。只有當(dāng)食物__________時，微生物的生長

才是停止的。

61019.一般情況下，微生物的____________抗

干燥能力較強，微生物這一特性已用于______________。

61020.利用干燥對微生物影響的原理，日常生

活中常用__________、__________、__________等方法保存食物。

61021.微生物的不同的生理生化過程有著

_______________________的最適溫度。

61022.__________________的乙醇?xì)⒕Ч?/p>

最好，實驗室空氣殺菌常用___________的福爾馬林熏蒸消毒。61023.高滲溶液會導(dǎo)致微生物細(xì)胞

_________________，低滲溶液會導(dǎo)致微生物細(xì)胞__________________。61024.細(xì)菌生長曲線中滯留適應(yīng)期的特點是

______，______，______。

61025.細(xì)菌生長曲線中對數(shù)生長期的特點是

_____________________。

61026.細(xì)菌生長曲線中最高穩(wěn)定生長期的特

點是_________________。

61027.細(xì)菌生長曲線中衰亡期的特點是

________________________。

61028.細(xì)菌純培養(yǎng)的生長曲線可分為

____________________________、_________________、________________、___________________等四個時期。61029.計算世代時間應(yīng)在細(xì)菌生長的______________期進行。

61030.生產(chǎn)中，為了長期維持對數(shù)生長期可采

取_____________________。

61031.如培養(yǎng)細(xì)菌的目的在于獲得大量菌體，應(yīng)在培養(yǎng)的_________________期進行收獲。

61032.一般來說，氧化還原電位(Eh)值在0.1V

以上，適宜_____________性微生物的生長，+0.1V以下，適合_______________性微生物的生長。61033.一般細(xì)菌的干重約為濕重的_________________________%。

61034.在生產(chǎn)上，要想使滯留適應(yīng)期縮短，可

采取________________________________等措施。

61035.巴斯德消毒法的工藝條件是

_________________________________。

61036.間歇滅菌法的具體方法

是:_____________________________________________________________________。

61037.室溫型微生物的最低生長溫度為_________________，最適生長溫度為_______________，最高生長溫度為___________________。

61038.高溫型微生物的最低生長溫度為______________________，最適生長溫度為_______________，最高生長溫度為_______________，主要分布在________________。

61039.兼性嗜冷性微生物的最低生長溫度為_____________，最適生長溫度為_____________，最高生長溫度為_____________，主要分布在____________________。

61040.專性嗜冷型微生物最低生長溫度為_____________，最適生長溫度為______________,最高生長溫度為____________，主要分布在____________________。

61041.土壤中的微生物的生長溫度類型一般是________________。

61042.植物病原微生物的生長溫度類型一般是__________________。

61043.常用的直接計數(shù)法有_________________、_______________、____________等。61044.常用的活菌計數(shù)法有___________________、_______________、____________等。61045.造成厭氧環(huán)境培養(yǎng)厭氧菌的方法有_______和_____________。

61046.低、中、高溫型微生物的最適生長溫度分別為__________、__________、___________。

61047.連續(xù)培養(yǎng)的方法主要有_______________和_______________兩種。

61048.根據(jù)微生物與氧氣的關(guān)系，可將微生物分成_____________、_____________、_________和_______________四個類型。

61049.酸菜，飼料青貯是利用______________發(fā)酵產(chǎn)生的____________抑制__________，使之得以長久貯存。61050.強酸、強堿有極強的_____________作用，而某些有機酸卻常用作_____________劑。

61051.常用的防腐方法有_________、__________、_________、________等。61052.水對微生物有如下生理功能:____________、______________、________________、________________。

61053.pH影響微生物生長的機制是___________、_______________、__________________________。

61054.極端嗜鹽的微生物可在濃度為

_________的鹽溶液中生長。

61055.面包，蛋糕中常加入________________

作為防腐劑。

61056.調(diào)味品飲料中常加入______________

作為防腐劑。

四、名詞解釋 61057.生長 61058.發(fā)育 61059.繁殖

61060.兼性厭氧菌 61061.好氧微生物 61062.厭氧微生物 61063.純培養(yǎng)體 61064.世代時間

61065.細(xì)菌生長曲線 61066.致死溫度 61067.致死時間 61068.分批培養(yǎng) 61069.連續(xù)培養(yǎng) 61070.微需氧細(xì)菌 61071.耐氧厭氧菌 61072.二元培養(yǎng) 61073.極端嗜鹽菌 61074.同步培養(yǎng)

五、問答題

61075.試述溫度對微生物的影響

61076.為什么秋天、冬天容易栽培平菇？ 61077.細(xì)菌的純培養(yǎng)生長曲線分為幾個時期，每個時期各有什么特點？

61078.試比較滅菌、消毒、防腐和化療之間的區(qū)別。

61079.試述涂片計數(shù)的基本方法

61080.怎樣用干重法測微生物的生長量？ 61081.為了防止微生物在培養(yǎng)過程中會因本

身的代謝作用改變環(huán)境的pH值，在配制培養(yǎng)基時應(yīng)采取什么樣的措施？ 61082.如何用比濁法測微生物的數(shù)量？ 61083.某細(xì)菌在t0時的菌數(shù)是102個/ml，經(jīng)過

400分鐘后，菌數(shù)增加到109

個/ml，計算該細(xì)菌的世代時間和繁殖的代數(shù)。61084.為什么加壓蒸汽滅菌比干熱滅菌的溫

度低？時間短？

第六章微生物的生長與環(huán)境條件答案

一、選擇題 60975.D 60976.B 60977.B 60978.A 60979.B 60980.A 60981.B 60982.B 60983.A 60984.A 60985.B 60986.B 60987.B 60988.C 60989.B

二、判斷題 60990.對 60991.錯 60992.錯 60993.錯 60994.錯 60995.錯 60996.對 60997.錯 60998.錯 60999.錯 61000.錯 61001.對 61002.對 61003.對 61004.對 61005.對

三、填空題

61006.專性嗜冷,兼性嗜冷。61007.室溫,體溫。61008.6.5-7.5。61009.7.5-8。61010.5-6。

61011.98kpa,121。C,30min。61012.真菌和放線菌。61013.代時。61014.中。

61015.前者殺死微生物的營養(yǎng)體，后者殺死所有微生物的細(xì)胞，包括細(xì)菌的芽胞。61016.高溫殺菌，化學(xué)殺菌，幅射殺菌。61017.低溫型，中溫型，高溫型。61018.慢，冰凍。

61019.孢子，菌種干燥保藏。61020.烘干，曬干，熏干。61021.不同。

61022.70%，2-6ml/M3。

61023.發(fā)生質(zhì)壁分離，吸水膨脹甚至破裂。61024.分裂遲緩，代謝活躍，菌數(shù)增長近于零。61025.細(xì)菌數(shù)以幾何級數(shù)增加。

61026.新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾

乎相等，此時活菌數(shù)最多。

61027.菌體的死亡數(shù)超過新生數(shù)。

61028.滯留適應(yīng)期，對數(shù)生長期，最高穩(wěn)定生

長期，衰亡期。61029.對數(shù)生長。61030.連續(xù)培養(yǎng)法。61031.最高穩(wěn)定。61032.好氧，厭氧。61033.20-25。

61034.加大接種量和采用處于對數(shù)生長期的菌種接種。

61035.62-63。C，30min或71。

C，15min。61036.常壓80-100℃處理15-60分鐘，37℃保

溫培養(yǎng)過夜，再同上蒸煮，如此連續(xù)三天。

61037.5℃，25-37℃，45-50℃。

61038.30℃，45-55℃，60-75℃，溫泉和堆肥

中。61039.-5-0℃，10-20℃，25-30℃，冷藏食品上。61040.-12℃，5-15℃，15-20℃，海洋深處、雪山等地。61041.中溫型的。61042.中溫型的。

61043.計數(shù)板計數(shù)法，涂片計數(shù)法，比濁法。61044.稀釋平板計數(shù)法，濾膜培養(yǎng)法，稀釋培

養(yǎng)法(MPN法)。

61045.化學(xué)吸氧法，密閉容器內(nèi)反復(fù)抽真空后

充N2。

61046.10-15℃，25-37℃，45-50℃。61047.恒濁法，恒化法。

61048.好氧，兼性厭氧，厭氧，微好氧。61049.乳酸菌，乳酸，腐生細(xì)菌。61050.殺菌，防腐。

61051.低溫防腐，加無毒的化學(xué)防腐劑，干燥

防腐，利用微生物產(chǎn)酸防腐。

61052.是細(xì)胞的組分，是生化反應(yīng)的介質(zhì)，是

吸收營養(yǎng)物質(zhì)和分泌代謝物的良好溶劑，能有效地控制細(xì)胞溫度。

61053.引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響微生

物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響代謝過程中酶的活性，改變環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性。

61054.25-30% 61055.丙酸鈣 61056.苯甲酸鈉

四．名詞解釋

61057.生長是指微生物的細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加過程。

61058.從生長到繁殖是一個量變到質(zhì)變的過

程，這個過程就是發(fā)育。

61059.由細(xì)胞分裂而引起的個體數(shù)目的增加，稱為繁殖。

61060.在有氧無氧條件下均能生長的細(xì)菌。61061.指在空氣或氧氣存在下生長的微生物。61062.在沒有空氣或氧氣條件下生活的微生物。

61063.經(jīng)過反復(fù)分離純化后，在平板上挑取的由單個菌落繁衍的微生物后代。

61064.單個細(xì)胞完成一次分裂所需的時間。61065.當(dāng)細(xì)菌在適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)時，如果以培養(yǎng)的時間為橫座標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)量變化為縱坐標(biāo)，根據(jù)細(xì)菌數(shù)量變化與相應(yīng)時間變化之間的關(guān)系，可以作出一條反應(yīng)細(xì)菌在培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線，這種曲線稱為生長曲線。

61066.在一定條件下(如10分鐘)，殺死某種微生物的最低溫度。

61067.在一定條件下(如60℃)殺死微生物所需要的最短時間。

61068.將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱為分批培養(yǎng)。

61069.細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線表明，細(xì)菌培養(yǎng)物的最高得率在對數(shù)生長期。通過控制環(huán)境條件，使細(xì)菌的生長始終保持在對數(shù)生長期，從而可以獲得更多的細(xì)菌培養(yǎng)物，這種方法稱為連續(xù)培養(yǎng)。

61070.指能在氧分壓低于正常大氣環(huán)境中表現(xiàn)最大生長速度的細(xì)菌。

61071.在分子氧存在下也能生活的厭氧菌。61072.二元培養(yǎng)是純培養(yǎng)的一種特殊形式。有些寄生微生物只能在寄生微生物體內(nèi)寄生，必須將寄生微生物和寄主微生物培養(yǎng)在一起，同時排除其它雜菌。例如培養(yǎng)蘇云金桿菌及其噬菌體，需先在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)蘇云金桿菌的細(xì)菌坪，然后在細(xì)菌坪上接種蘇云金桿菌的噬菌體，經(jīng)培養(yǎng)后，在蘇云金桿菌的細(xì)菌坪上出現(xiàn)噬菌體感染的透明空斑，這種培養(yǎng)方法稱為二元培養(yǎng)。

61073.在15%以上鹽濃度下才能生長，最適生長的鹽濃度為25-30%的嗜鹽菌稱為極端嗜鹽菌。

61074.采用物理或者化學(xué)的方法使微生物處于比較一致的生長發(fā)育階段上的培養(yǎng)方法叫同步培養(yǎng)。例如利用孔徑大小不同的濾膜，將大小不同的細(xì)胞分開培養(yǎng)，可使同一大小的細(xì)胞處于同一生長階段。

五．問答題

61075.溫度對微生物的影響可概括為：

1適宜的溫度有利于微生物的生長

2高溫可使菌體蛋白變性，導(dǎo)致微生物死亡，常用高溫進行消毒滅菌低溫對微生物具有抑制或殺傷作用，故低溫用于保藏食品

61076.秋天之所以容易栽培平菇是因為： 秋冬病蟲害少平菇子實體形成溫度比菌絲生長溫度要低，當(dāng)菇床菌絲長滿以后，適當(dāng)降溫，(秋冬天降溫容易)，有利于平菇子實體的形成。

61077.細(xì)菌的純培養(yǎng)生長曲線分為四個時期，即滯留期，對數(shù)生長期，最高穩(wěn)定生長期和衰亡期。

滯留期的特點是：分裂遲緩，代謝活躍。

對數(shù)生長期的特點是：細(xì)菌數(shù)量以幾何級數(shù)增加。

最高穩(wěn)定生長期的特點是：新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等。

衰亡期的特點是；活菌數(shù)按幾何級數(shù)下降。

61078.滅菌是殺死所有微生物

消毒是殺死或消除所有病原微生物，達到防止病原菌傳播的目的防腐是利用理化因子使微生物暫不生長

化療是有效地消除宿主體內(nèi)的微生物

61079.取載玻片一塊，用蠟筆在中央畫出一平

方厘米的面積。將待測樣品稀釋到一定濃度后取0.01毫升菌液滴在載玻片上的一平方厘米面積上。然后在顯微鏡下計數(shù)每個視野的菌數(shù)(至少數(shù)10個視野，計算平均菌數(shù))。將視野的面積算出來后，按下列公式計算樣品中的含菌數(shù)。

1平方厘米

每克樣品中的含菌數(shù)＝--------------------?每個視野的平均菌數(shù)?100?稀釋倍數(shù) 視野面積 3水蒸汽有潛熱。

61080.干重法主要用來測發(fā)酵液中絲狀真菌

或放線菌的生長量。

取一定量的發(fā)酵液(如100毫升)過濾

后連同濾紙一道烘干至恒重后稱重，然后再減去濾紙的干重，即為100毫升發(fā)酵液中某種微生物干物質(zhì)的量。

61081.為了防止微生物在培養(yǎng)過程中因自身的代謝作用產(chǎn)酸或產(chǎn)堿改變環(huán)境的pH值，通常在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入緩沖物質(zhì)如磷酸鹽或碳酸鈣。

61082.用比濁法測定微生物的數(shù)量主要是在工業(yè)生產(chǎn)中采用，它的特點是快速。

在測定前首先必需繪制出濁度與數(shù)量的相關(guān)曲線，濁度用光電比色計測定，菌數(shù)靠用稀釋平板法測定或用計數(shù)板測定。曲線繪好后，在生產(chǎn)中，只要用比色計測出菌液的任一濁度后就可以從曲線上查出相應(yīng)的菌數(shù)。

61083.在t0時菌數(shù)X=100

在t1時菌數(shù)Y=1000000000

n(代數(shù))=3.3lg(y/x)=3.3(lg109-lg102)=3.3×7=23.1

代時G=(400-0)÷23.1=17.3

在上述培養(yǎng)中，該菌的代時為17.3分鐘，400分鐘內(nèi)共繁殖了23.1代。

61084.原因有三條：

1蛋白質(zhì)在有水的條件下變性溫度比無水時的變性溫度要低。

2水蒸汽的穿透力比熱空氣的穿透

力強。

第五篇：微生物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學(xué)研究工作中最常應(yīng)用的實驗技術(shù)。一方面，在一個新的病害研究中，通過分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學(xué)特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長的營養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經(jīng)以以幾個步驟: 1.有關(guān)器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養(yǎng)基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養(yǎng)。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體，在植物病理學(xué)實驗中，需要進行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進行嚴(yán)格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、輻射和使用化學(xué)藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)疑固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時間長1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進行灼燒滅菌。通常所說的干熱滅菌是在烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣(160～170℃)進行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。

進行干熱滅菌要注意以下問題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫；電烘箱內(nèi)溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.1MPa，121℃保持15～30 min進行滅菌。時間的長短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行，也可用普通蒸籠進行滅菌。由于常壓，其溫度不超過100℃，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而芽孢細(xì)菌卻不能在短時間內(nèi)殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細(xì)菌，達到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內(nèi)，每天加熱100℃，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱100℃，30 min，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。

(二)過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過濾器有：

(1)蔡氏過濾器 該過濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過濾時，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據(jù)其孔徑大小，濾板分為3種型號：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細(xì)菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過。使用時可根據(jù)需要選用。

(2)微孔濾膜過濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過濾到無菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時，用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過濾膜。

提示: 整個過程應(yīng)在無菌條件下嚴(yán)格無菌操作以防污染，過濾時應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項: 紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優(yōu)點是穿透力強，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學(xué)藥品滅菌

化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細(xì)菌代謝機能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數(shù)抗生素等。化學(xué)藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時間長短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。

植物病理學(xué)實驗室中常用的化學(xué)藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學(xué)和整個生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價值。根據(jù)不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養(yǎng)基的制作

1、目的要求

了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無機鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適pH范圍內(nèi)才能生長得更好，因此，對不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍。－般而言，真菌調(diào)節(jié)到微酸，細(xì)菌調(diào)節(jié)到微堿。

培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)來源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類。天然培養(yǎng)基是以自然界原有的有機物為材料經(jīng)滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機物質(zhì)，又有一些成分簡單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無任何成分不明確的物質(zhì)，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。

根據(jù)培養(yǎng)基用途不同，可分為生長繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。

在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計)、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15 g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時，適當(dāng)增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣。

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。

(5)分裝 根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，可將配制的培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經(jīng)彈松的棉花，棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學(xué)研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過緊時妨礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的，且棉塞過小往往容易掉進試管內(nèi)。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。

培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無菌生長者方可使用。

PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿破壞培養(yǎng)基成分。

三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術(shù)。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。病原細(xì)菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉?。ü?Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細(xì)菌性角斑病（葉）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯病（葉）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐?。ㄈ~）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實驗操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養(yǎng)皿一個，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無菌操作應(yīng)注意下面幾點：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺內(nèi)；操作前用肥皂洗手，操作時還需用70 ％酒精擦拭雙手；無菌操作時，呼吸要輕，不要說話。

（2）用無菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細(xì)菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現(xiàn)污染細(xì)菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目咕匾种萍?xì)菌的生長，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細(xì)菌生長；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細(xì)菌生長；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細(xì)菌的生長。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應(yīng)在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時加入。倒平板過程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長3～4 mm)病組織數(shù)塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應(yīng)在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數(shù)秒至l min)升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時間3～5 min。

(5)用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。

(6)將培養(yǎng)皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3～4 d后觀察待分離菌生長結(jié)果。

(7)若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據(jù)菌落的一致性初步確定長出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，進一步確定。如果是對未知病原菌的組織分離，則要將長出的菌落分別轉(zhuǎn)出，通過進一步的接種實驗明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實)，在分離過程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個，平放在濕紗布上，編號，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再從第一個培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養(yǎng)基，分別倒在三個培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個培養(yǎng)皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后臵恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長情況。

(6)挑菌 將培養(yǎng)后長出較為整齊一致的單個菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，臵25℃左右培養(yǎng)。待菌長出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。

(二)病原細(xì)菌的分離

病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應(yīng)對病組織材料進行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環(huán))；蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26～28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1～3 d后觀察有無細(xì)菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中的優(yōu)勢單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。

(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀

1．真菌培養(yǎng)性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進行，待某培養(yǎng)皿中形成單個菌落后觀察。記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長速度快慢等。同時要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

2．細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環(huán))蘸細(xì)菌菌種后，通過無菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養(yǎng)基表面從下向上劃一直線，過2～3 d后長出的細(xì)菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細(xì)菌菌落的記載內(nèi)容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，是否有特殊氣味生成，生長速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環(huán))蘸取細(xì)菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數(shù)日后觀察記載培養(yǎng)基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。