第一篇：質(zhì)粒DNA抽提實驗報告

質(zhì)粒DNA抽提實驗報告

一．實驗?zāi)康模?/p>

1.掌握堿裂解法小量快速提取質(zhì)粒DNA的方法，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切，PCR擴增等。

2.學(xué)習(xí)利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測DNA的純度，構(gòu)型，含量和分子量大小。

二．實驗原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DN結(jié)果A的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三．實驗儀器及試劑：

1.5mlEP管、高速離心機、移液槍

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．實驗步驟:

1、取1.5ml細(xì)胞培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1min，去上清液（重復(fù)一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重懸浮細(xì)胞

3、加200μl溶液Ⅱ，輕輕搖勻，放置5min

4、加150μl溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min

5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min

6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min 7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存?zhèn)溆?/p>

五．實驗結(jié)果：得到大腸桿菌質(zhì)粒DNA

PCR以及電泳實驗報告

一．實驗原理：

PCR：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時蛋白質(zhì)分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。

二．實驗儀器及試劑：

EP管、離心機、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測儀等 DNA模板、與特定DNA模板結(jié)合的引物、去離子水、商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠

三．PCR反應(yīng)體系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步驟 1、94℃預(yù)變性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循環(huán)7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循環(huán)23次 3、72℃，10s

4、電泳檢測

五．實驗結(jié)果分析

分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見下表：

如右圖所示：實驗所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實驗的DNA條帶位置在500bp-750bp之間，接近500bp，證明實驗是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 實驗組

對照組

第二篇：質(zhì)粒DNA的抽提與純化 (附注問題非常詳細(xì))

質(zhì)粒DNA的抽提與純化(附注問題非常詳細(xì))

目的： 采用堿變性法，學(xué)習(xí)小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA的技術(shù)

原理： 堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

儀器與主要試劑 儀器（見附錄）：

主要試劑： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液 TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA

實驗方法：

1．將大腸桿菌菌落挑取一環(huán)接種在含有2毫升加入抗菌素的LB液體培養(yǎng)基的10毫升試管里，37℃振培過夜，16～18小時

2．轉(zhuǎn)移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm離心30秒

3．小心去除上清，并用吸水紙吸干殘余液體，再將沉淀物在振蕩器上振勻 4．加入溶液I 100μl，蓋緊EP管蓋，翻轉(zhuǎn)數(shù)次，冰上放置10分鐘

5．加入溶液II 200μl，溫和翻轉(zhuǎn)EP管5次(可觀察到溶液逐步由混濁變?yōu)橥该?，冰上放置5分鐘

6．加入溶液III 150μl，將EP管蓋緊后累累來回翻轉(zhuǎn)23次，混勻后冰上放置20分鐘

7．12000rpm離心15分鐘 8．將上清轉(zhuǎn)移到另一個EP管中(吸取時不可吸入底部的沉淀)。加入等體積的酚和氯仿：異戊醇各抽提一次

9．加入1毫升預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，蓋緊，并翻轉(zhuǎn)EP管數(shù)次混勻

10． 置于-20℃冰箱1～2小時

11． 15000rpm離心15分鐘，去除上清，收集管底白色沉淀 12． 70%乙醇洗滌一次，空氣干燥或真空抽干

13． 將沉淀溶于50μl TE緩沖液或去離子水，完全溶解后，-20℃保存 14． 取樣5μl，在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察DNA條帶。

附注：

1．溶液Ⅰ--－溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中PH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。EDTA的作用：

（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時一定的金屬離子作輔基）。

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。

2．溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2mol/L,加抽提液時，該系統(tǒng)的PH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性.SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3…R┿-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。3．溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸.所以該溶液實際上是NaAc-Hac的緩沖液.用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液,調(diào)回PH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在.而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA,RNA,以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之.前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更完全.4.為什么用無水乙醇沉淀DNA? 用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng),對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑.DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當(dāng)加入乙醇時,乙醇會奪DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇來替代懈水乙醇(因為無水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴).但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率.折中的做法初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA.一般在室溫下放置15-30分鐘即可.5.在用無水乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAC或NaCL至最終濃度達(dá)0.1－0.25MOL/L? 在Ph為8左右的DNA溶液中,DNA分子是帶負(fù)電荷的,加一定濃度的NaAC或NaCL,使Na2+中和DNA分子上的負(fù)電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不完全,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA的酶切等反應(yīng),必須要進行洗滌或重沉淀.6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與Kac來處理? 加進去的Rnaese本身是一種蛋白質(zhì),為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,再加Kac使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使沉淀更加完全.也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到較好的效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2）和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍,可作DNA的保存液,但在轉(zhuǎn)化實驗時,磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應(yīng)時,不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng),由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,大都采用Tris-HCL系統(tǒng),而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性.8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達(dá)20%.本實驗選擇性沉淀4.3Kb的pBR322質(zhì)粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最終PEG濃度為12%.PEG選擇性沉淀DNA的分辯率大約100bp.9.抽提DNA去除蛋白質(zhì)時,怎樣使用酚與氯仿較好? 酚與氯仿是非極性分子,水是極性分子,當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時,蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去使蛋白失去水合狀態(tài)而變性.經(jīng)過離心,變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,從而與溶解在水相中的DNA分開.而酚與氯仿有機溶劑比重更大,保留在最下層.作為表面變性的酚與氯仿,在去除蛋白質(zhì)的作用中,各有利弊,酚的變性作用大,但酚與水想有一定程度的互溶,大約10%~15%的水溶解在酚相中,因而損失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效果好,但氯仿與水不相混溶,不會帶走DNA.所以在抽提過程中,混合使用酚與氯仿效果最好.經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚,由于酚與氯仿是互溶的,可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì),此時一起將酚帶走.也可以在第二次抽提時,將酚與氯仿混合(1:1)使用.10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時,還要加少量的異戌醇? 在抽提DNA時,為了混合均勻,必須劇烈振蕩容光煥發(fā)器數(shù)次,這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡,氣泡會阻止相互間的充分作用.加入異戌醇能降低分子表面張力,所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生.一般采用氯仿與異戌醇為24:1之比.也可以采用酚,氯仿與異戌醇之比為25:24:1(不必先配制,可在臨用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互異戌醇即成,)節(jié)同時異戌醇有助于分相,使離必后的上層水相,中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定.11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化? 因為酚與水有一定的互溶.苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失.用Tris調(diào)節(jié)至PH為8是因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定.在中性或堿性條件下(PH5~7),RNA比DNA更容易游離到水相,所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品.保存在冰箱中的酚,容易被空氣氧公而變成粉紅色的,這樣的酚容易降解DNA,一般不可以使用.為了防止酚的氧化,可加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%.8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末,不僅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚,最好分裝在棕色小試劑瓶里,上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子這宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或-20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

第三篇：質(zhì)粒抽提常見問題與解答

1.沒有提出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒收獲量很低

A菌種老化

建議：對于甘油保存的菌種，需要先進行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進行液體培養(yǎng)，并對菌種進行初搖活化，按照1:500的比例進行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)時間最好不要超出16小時(或者OD600不超過3.0)。

B低拷貝質(zhì)粒

建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量。

C質(zhì)粒丟失

建議：某些質(zhì)粒在次繼代培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。

D裂解不充分

建議：如果采用超過推薦量的菌體進行質(zhì)粒制備，會導(dǎo)致菌體裂解不充分?？蛇m當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。

EBuffer中有沉淀未溶解

建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時會出現(xiàn)沉淀，使用前請檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建議：按照說明書要求加入要求量的無水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。另外對于質(zhì)粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請確保乙醇的體積不小于70%。

G離心柱中乙醇?xì)埩?/p>

建議：漂洗后，可適當(dāng)延長離心時間，盡量去除殘留的乙醇。另外對于質(zhì)粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹片刻(或置于65℃烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實驗操作。

H洗脫液加入位置不正確

建議：洗脫液應(yīng)加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。

I洗脫液pH值不正確

建議：將DNA從柱子上洗脫下來的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果，請使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進行洗脫，如果用ddH2O進行洗脫，請確保pH在7.0-8.5之間。

J洗脫體積的選擇

建議：洗脫體積將會影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會降低。請使用試劑盒推薦的洗脫體積進行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，請根據(jù)試劑盒要求進行二次洗脫，再用推薦的方法進行沉淀，濃縮質(zhì)粒。

K洗脫時間的選擇

建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。

2.質(zhì)粒純度不高

A蛋白質(zhì)污染

建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來稀釋。

BRNA污染

建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應(yīng)該存放在4℃，如果存放時間過長，或者沒有正確存放，RNaseA活力下降，請重新加入RNaseA。

C基因組DNA污染

建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時間最好不要超過5分鐘。

D菌株為含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株

建議：請選用含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株質(zhì)粒DNA提取試劑盒，或者轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到不含內(nèi)源核酸酶宿主菌株中。

3.加樣時DNA飄出加樣孔外

原因：柱中殘留乙醇未除干凈。

建議：洗脫質(zhì)粒DNA前確保無乙醇?xì)埩粼谥由??？稍匐x心或者抽真空。

第四篇：DNA抽提試劑盒簡介

一．上海生工的試劑盒：

1.基因組小量抽提試劑盒

BS47350Extractions350元BBI

BS474100Extractions420元BBI

SK125150次280元Sangon

SK1252100次380元Sangon

基本說明：通過將組織細(xì)胞裂解后，以RnaseA和Proteinase K消化降解RNA和蛋白質(zhì)。然后經(jīng)過簡單抽提、沉淀獲得基因組DNA。本試劑盒適用于從人或動物的血液、培養(yǎng)細(xì)胞、各種組織、Gram+/Gram-細(xì)菌中快速抽提基因組DNA。

主要特點：1.整個抽提過程30分鐘，氯仿抽提僅一次，無需酚抽提。

2.本試劑盒抽提DNA能用于幾乎所有生物學(xué)實驗。

3.按樣品準(zhǔn)備方法得到的200微升樣品中可獲得2~10微克DNA。

2.UNIQ-10柱式血液基因組抽提試劑盒

BS48350Extractions390元BBI

BS484100Extractions760元BBI

SK126150次380元Sangon

SK1262100次690元Sangon

基本說明：UNIQ-10柱含有特異性吸附DNA的膜。利用最新研發(fā)的血液處理試劑，能特異有效地將血液中白細(xì)胞的DNA釋放到溶液上清中，有利于膜對血液基因組DNA的吸附。經(jīng)洗滌除去非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，然后用Elution Buffer洗脫。試用于從人和動物外周血貨其他途徑收集的血液中抽提基因組DNA。

主要特點：1.抓們針對血液基因組DNA的抽提。

2.DNA純度好，產(chǎn)率高。

3.快速、簡便。

第五篇：血液標(biāo)本抽提DNA

抗凝全血中提取DNA

準(zhǔn)備： 配制80%異丙醇和70%乙醇各1ml備用。選擇2ml的 離心管。血液的體積為2ml。先向2ml的離心管中加入1ml的血液。后加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。再加入1ml的血液，再加入1ml的buffer MG-A，劇烈搖晃20次；10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。注意： 使用底部帶有棱角的離心管，以防倒上清時，沉淀滑出離心管。

如果血液體積超過1/2離心管的體積，可分兩次進行處理。目的：buffer MG-A的作用是快速裂解細(xì)胞，并且促使DNA形成容易沉淀的凝聚物。加入1ml的buffer MG-A。Vortex充分震蕩，10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。加入1ml的buffer MGS, Vortex充分震蕩，10000xg 離心30s，緩慢倒掉上清。將離心管倒扣在吸水上2min；或者簡短離心，仔細(xì)吸除殘留的上清。

目的： 洗滌去除DNA凝聚物中的蛋白。加入1ml buffer MGL和10ul Proteinase K，Vortex震蕩懸浮沉淀。6 65℃水浴30min（或者更長時間，可過夜），間斷搖晃混合。目的：降解蛋白，釋放DNA 10000xg 離心 30s，將上清緩慢倒入一個干凈的2ml的離心管，加入800ul 80%異丙醇；緩慢翻轉(zhuǎn)離心管20次（出現(xiàn)絲狀或簇裝DNA凝聚物）,再劇烈搖晃20次使DNA凝聚物變得更緊密。10000xg 30s，緩慢倒掉上清。

注意： 在出現(xiàn)絲狀或簇狀DNA凝聚物后，需劇烈搖晃去除可能包裹在DNA凝膠中的溶液，不然最后DNA溶解困難，或DNA中有鹽殘留。

在出現(xiàn)DNA凝聚物之前，DNA為溶解狀態(tài)，需要緩慢翻轉(zhuǎn)離心管。目的：異丙醇能夠沉淀DNA 加入1000ul 70% 乙醇，劇烈搖晃20次；10000xg 離心 30s，緩慢倒掉上清。

目的：洗滌去除鹽成分。將離心管倒置在干凈的吸水紙上至少5min，或者簡短離心，仔細(xì)吸除殘留的乙醇（勿吸除沉淀）。室溫放置10min或者37℃ 放置5min揮發(fā)乙醇，干燥至DNA沉淀為半濕潤狀態(tài)，無酒精味，效果最佳。目的：干燥揮發(fā)乙醇。加入至少200ulTE，提速Vortex 震蕩5s或者劇烈搖晃10次，65℃水浴10-60min 溶解DNA，水浴5min后輕彈離心管底部打散DNA凝聚物（一般繼續(xù)水浴10min 后即可完全溶解）；或者65℃水浴過夜。

注意：水浴后，DNA為溶解狀態(tài)，應(yīng)避免劇烈操作。目的：溶解DNA。