第一篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)講義 朱玉賢
分子生物學(xué)課程教學(xué)講義 朱玉賢
第一講 序論
二、現(xiàn)代分子生物學(xué)中的主要里程碑
分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。當(dāng)人們意識(shí)到同一生物不同世代之間的連續(xù)性是由生物體自身所攜帶的遺傳物質(zhì)所決定的，科學(xué)家為揭示這些遺傳密碼所進(jìn)行的努力就成為人類征服自然的一部分，而以生物大分子為研究對(duì)像的分子生物學(xué)就迅速成為現(xiàn)代社會(huì)中最具活力的科學(xué)。
從1847年Schleiden和Schwann提出“細(xì)胞學(xué)說”，證明動(dòng)、植物都是由細(xì)胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時(shí)間，我們對(duì)生物大分子--細(xì)胞的化學(xué)組成卻有了深刻的認(rèn)識(shí)。孟德爾的遺傳學(xué)規(guī)律最先使人們對(duì)性狀遺傳產(chǎn)生了理性認(rèn)識(shí)，而Morgan的基因?qū)W說則進(jìn)一步將“性狀”與“基因”相耦聯(lián)，成為分子遺傳學(xué)的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。在蛋白質(zhì)化學(xué)方面，繼Sumner在1936年證實(shí)酶是蛋白質(zhì)之后，Sanger利用紙電泳及層析技術(shù)于1953年首次闡明胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了蛋白質(zhì)序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術(shù)解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結(jié)構(gòu)，論證了這些蛋白質(zhì)在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構(gòu)型的先驅(qū)。1910年，德國(guó)科學(xué)家Kossel第一個(gè)分離了腺嘌呤，胸腺嘧啶和組氨酸。
1959年，美國(guó)科學(xué)家Uchoa第一次合成了核糖核酸，實(shí)現(xiàn)了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。同年，Kornberg實(shí)現(xiàn)了試管內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞中DNA的復(fù)制。
1962年，Watson（美）和Crick（英）因?yàn)樵?953年提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后者通過X射線衍射證實(shí)了Watson-Crick模型。
1965年，法國(guó)科學(xué)家Jacob和Monod提出并證實(shí)了操縱子（operon）作為調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞代謝的分子機(jī)制。此外，他們還首次推測(cè)存在一種與DNA序列相互補(bǔ)、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所（細(xì)胞質(zhì)）并翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRNA（信使核糖核酸）。
1972年，Paul Berg（美）第一次進(jìn)行了DNA重組。
1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次進(jìn)行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)遺傳因子（jumping gene或稱mobile element）而獲得Nobel獎(jiǎng)。
1993年，美國(guó)科學(xué)家Roberts和Sharp因發(fā)現(xiàn)斷裂基因（introns）而獲得Nobel獎(jiǎng)。Mullis由于發(fā)明PCR儀而與加拿大學(xué)者Smith（第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變）共享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。
此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人關(guān)于致病力強(qiáng)的光滑型（S型）肺炎鏈球菌DNA導(dǎo)致致病力弱的粗糙型（R型）細(xì)菌發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)；Hershey和Chase（1952）關(guān)于DNA是遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)；Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律（即中心法則）:Meselson和Stahl（1958）關(guān)于DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)以及Yanofsky和Brener（1961）年關(guān)于遺傳密碼三聯(lián)子的設(shè)想都為分子生物學(xué)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。
我國(guó)生物科學(xué)家吳憲20世紀(jì)20年代初回國(guó)后在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究，成為我國(guó)生物化學(xué)界的先驅(qū)。20世紀(jì)60年代、70年代和80年代，我國(guó)科學(xué)家相繼實(shí)現(xiàn)了人工全合成有生物學(xué)活性的結(jié)晶牛胰島素，解出了三方二鋅豬胰島素的晶體結(jié)構(gòu)，采用有機(jī)合成與酶促相結(jié)合的方法完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜結(jié)構(gòu)與功能等方面都有世所矚目的建樹。
三、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容
所有生物體中的有機(jī)大分子都是以碳原子為核心，并以共價(jià)鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構(gòu)成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機(jī)大分子都是由完全相同的單體，如蛋白質(zhì)分子中的20種氨基酸、DNA及RNA中的8種堿基所組合而成的，由此產(chǎn)生了分子生物學(xué)的3條基本原理：
1． 構(gòu)成生物體有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是相同的； 2． 生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循著各自特定的規(guī)則； 3． 某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容: DNA重組技術(shù)------基因工程 基因表達(dá)調(diào)控-------核酸生物學(xué)
生物大分子結(jié)構(gòu)功能----結(jié)構(gòu)分子生物學(xué) DNA重組技術(shù)（又稱基因工程）
這是20世紀(jì)70年代初興起的技術(shù)科學(xué)，目的是將不同DNA片段（如某個(gè)基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。嚴(yán)格地說，DNA重組技術(shù)并不完全等于基因工程，因?yàn)楹笳哌€包括其他可能使生物細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)得到改造的體系。DNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、酶工程及微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)長(zhǎng)期深入研究的結(jié)晶，而限制性內(nèi)切酶DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。
DNA重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景:DNA重組技術(shù)可用于定向改造某些生物基因組結(jié)構(gòu)，使它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重組技術(shù)還被用來進(jìn)行基礎(chǔ)研究。如果說，分子生物學(xué)研究的核心是遺傳信息的傳遞和控制，那么根據(jù)中心法則，我們要研究的就是從DNA到RNA，再到蛋白質(zhì)的全過程，也即基因的表達(dá)與調(diào)控。在這里，無(wú)論是對(duì)啟動(dòng)子的研究（包括調(diào)控元件或稱順式作用元件），還是對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分析，都離不開重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。
基因表達(dá)調(diào)控研究
因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子參與并控制了細(xì)胞的一切代謝活動(dòng)，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時(shí)序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列，所以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時(shí)序發(fā)生變化（時(shí)序調(diào)節(jié)），并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正（環(huán)境調(diào)控）。
原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)都比真核生物簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時(shí)間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在時(shí)間和空間上都被分隔開，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復(fù)雜的信息加工過程，其基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同的水平上?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號(hào)傳導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及RNA剪輯3個(gè)方面。
轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。
真核基因在結(jié)構(gòu)上的不連續(xù)性是近10年來生物學(xué)上的重大發(fā)現(xiàn)之一。當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之外，還要將隔開各個(gè)相鄰編碼區(qū)的內(nèi)含子剪去，使外顯子（編碼區(qū)）相連后成為成熟mRNA。研究發(fā)現(xiàn)，有許多基因不是將它們的內(nèi)含子全部剪去，而是在不同的細(xì)胞或不同的發(fā)育階段有選擇地剪接其中部分內(nèi)含子，因此生成不同的mRNA及蛋白質(zhì)分子。
結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)
生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究（又稱結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）一個(gè)生物大分子，無(wú)論是核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提:首先，它擁有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）；其次，在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過程中必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。
結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。它包括結(jié)構(gòu)的測(cè)定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)變化規(guī)律的探索及結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的建立3個(gè)主要研究方向。最常見的研究三維結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動(dòng)規(guī)律的手段是X射線衍射的晶體學(xué)（又稱蛋白質(zhì)晶體學(xué)），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液相結(jié)構(gòu)，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。
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第二講 染色體與DNA
一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)
Avery在1944年的研究報(bào)告中寫道：“當(dāng)溶液中酒精的體積達(dá)到9/10時(shí)，有纖維狀物質(zhì)析出。如稍加攪拌，它就會(huì)象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質(zhì)并重復(fù)數(shù)次，可提高其純度。這一物質(zhì)具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它很可能就是DNA（誰(shuí)能想到?。薄?duì)DNA分子的物理化學(xué)研究導(dǎo)致了現(xiàn)代生物學(xué)翻天覆地的革命，這更是Avery所沒有想到。
所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。核苷酸序列對(duì)DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復(fù)的DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)，它主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在，其基本特點(diǎn)是：
1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的。
2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。
3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對(duì)的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系叫堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對(duì)方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個(gè)不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。
二、DNA聚合酶與DNA的合成
The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意義及成分分析
早在1928年英國(guó)科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒性（致病力）是由細(xì)胞表面莢膜中的多糖所決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因?yàn)閹в星v膜多糖而都能使小鼠發(fā)病，而具有粗糙外表的R型因?yàn)闆]有莢膜多糖而失去致病力（莢膜多糖能保護(hù)細(xì)菌免受運(yùn)動(dòng)白細(xì)胞攻擊）。
首先用實(shí)驗(yàn)證明基因就是DNA分子的是美國(guó)著名的微生物學(xué)家Avery。Avery等人將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細(xì)菌自然喪失了致病能力。再用活的粗糙型細(xì)菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因?yàn)榇植谛图?xì)菌天然無(wú)致病力。當(dāng)他們將經(jīng)燒煮殺死的S型細(xì)菌和活的R型細(xì)菌混合再感染小鼠時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠每次都死了。解剖死鼠，發(fā)現(xiàn)有大量活的S型（而不是R型）細(xì)菌。他們推測(cè)，死細(xì)菌中的某一成分棗轉(zhuǎn)化源（transforming principle）將無(wú)致病力的細(xì)菌轉(zhuǎn)化成病原細(xì)菌。
美國(guó)冷泉港卡內(nèi)基遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家Hershey和他的學(xué)生Chase在1952年從事噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。噬菌體專門寄生在細(xì)菌體內(nèi)。它的頭、尾外部都有由蛋白質(zhì)組成的外殼，頭內(nèi)主要是DNA。噬菌體侵染細(xì)菌的過程可以分為以下5個(gè)步驟：①噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細(xì)菌表面；②噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，噬菌體的蛋白質(zhì)外殼則留在細(xì)胞外面；③噬菌體的DNA一旦進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，它就能利用細(xì)菌的生命過程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質(zhì)；④新合成的DNA和蛋白質(zhì)外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；⑤子代噬菌體由于細(xì)菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細(xì)菌。他們發(fā)現(xiàn)被感染的細(xì)菌中帶有70%的噬菌體DNA，但只帶有20%的噬菌體蛋白質(zhì)。子代噬菌體中帶有50%標(biāo)記的DNA，卻只有1%的標(biāo)記蛋白質(zhì)。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色體結(jié)構(gòu)
DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬(wàn)個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為genomes（基因組）。如果設(shè)想將人體細(xì)胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個(gè)堿基大約只占1－5厘米，而一個(gè)2－3kb的基因只相當(dāng)于地球上一條數(shù)十米長(zhǎng)，數(shù)厘米寬的線段！
Genotype(基因型)： The genetic constitution of a given organism(指某個(gè)特定生物體細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳物質(zhì))。Phenotype(表現(xiàn)型)： Visible property of any given organism(某個(gè)特定生物體中可觀察到的物理或生理現(xiàn)象)。Mutations： 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。
六、染色體的組成1．染色質(zhì)和核小體
染色質(zhì)DNA的Tm值比自由DNA高，說明在染色質(zhì)中DNA極可能與蛋白質(zhì)分子相互作用；在染色質(zhì)狀態(tài)下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性大大低于在自由DNA中的反應(yīng)；DNA酶I（DNaseI）對(duì)染色質(zhì)DNA的消化遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于對(duì)純DNA的作用。染色質(zhì)的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結(jié)構(gòu)，可以看到由一條細(xì)絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。
核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長(zhǎng)度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色體中含3.3×109堿基對(duì)，其理論長(zhǎng)度應(yīng)是180cm，這么長(zhǎng)的DNA被包含在46個(gè)51μm長(zhǎng)的圓柱體（染色體）中，其壓縮比約為104。
2．染色體中的核酸組成
⑴不重復(fù)序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復(fù)序列長(zhǎng)約750－2000dp，相當(dāng)于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的長(zhǎng)度。單拷貝基因通過基因擴(kuò)增仍可合成大量的蛋白質(zhì)，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個(gè)絲心蛋白mRNA，每個(gè)mRNA可存活4d，共合成105個(gè)絲心蛋白，這樣，在幾天之內(nèi)，一個(gè)單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個(gè)絲心蛋白分子。
⑵中度重復(fù)序列 這類重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。
非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，這些單位在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)約5000次。在卵細(xì)胞形成過程中這些基因可進(jìn)行幾千次不同比例的復(fù)制，產(chǎn)生2×106個(gè)拷貝，使rDNA占卵細(xì)胞DNA的75%，從而使該細(xì)胞能積累1012個(gè)核糖體。
⑶高度重復(fù)序列——衛(wèi)星DNA 這類DNA只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%—60%，由6—100個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)幾百萬(wàn)次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復(fù)序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶（峰）。
高等真核生物DNA無(wú)論從結(jié)構(gòu)還是功能看都極為復(fù)雜，以小鼠為例：
1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復(fù)序列，重復(fù)數(shù)十萬(wàn)到上百萬(wàn)次/genome。
2.總DNA的20％是重復(fù)數(shù)千次、長(zhǎng)約數(shù)百bp的中等重復(fù)序列。
3.總DNA的70％是不重復(fù)或低重復(fù)序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。
Centromere：是細(xì)胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質(zhì)與染色體的結(jié)合位點(diǎn)（attachment point），這種結(jié)合對(duì)于染色體對(duì)在子細(xì)胞中的有序和平均分配至關(guān)重要。在酵母中，centromere的功能單位長(zhǎng)約130 bp，富含AT 堿基對(duì)。在高等真核細(xì)胞中，centromere都是由長(zhǎng)約5－10 bp、方向相同的高度重復(fù)序列所組成。
Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精確重復(fù)序列所組成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n 其中X、Y一般為1－4，單細(xì)胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中>1500。染色體末端的線性重復(fù)序列不能被DNA polymarase 所準(zhǔn)確復(fù)制，它們一般在DNA復(fù)制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。
Alu（長(zhǎng)約300bp）是人類高度重復(fù)序列,因?yàn)樵撔蛄兄袔в蠥luI的識(shí)別序列而得名。數(shù)十萬(wàn)個(gè)Alu重復(fù)序列散布于整個(gè)人類 如果注射后經(jīng)數(shù)小時(shí)（或數(shù)天）收獲肝臟，所有細(xì)胞成份中都帶有放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì);如果注射后幾分鐘內(nèi)即收獲肝臟，那么，放射性標(biāo)記只存在于含有核糖體顆粒的細(xì)胞質(zhì)成份中。 （2）Francis Crick等人第一次證實(shí)只有用三聯(lián)子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個(gè)字母組成遺傳信息（核酸）準(zhǔn)確無(wú)誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)1: 用吖啶類試劑（誘導(dǎo)核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點(diǎn)上的兩個(gè)基因，使之發(fā)生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒有功能的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)2: 研究煙草壞死衛(wèi)星病毒發(fā)現(xiàn)，其外殼蛋白亞基由400個(gè)氨基酸組成，相應(yīng)的RNA片段長(zhǎng)1200個(gè)核苷酸，與密碼三聯(lián)子體系正好相吻合。實(shí)驗(yàn)3: 以均聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質(zhì)因子的細(xì)胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時(shí)又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時(shí)發(fā)現(xiàn)合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。實(shí)驗(yàn)4: 以特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個(gè)氨基酸組成的多肽，5'?UGU GUG UGU GUG UGU GUG?3',不管讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。實(shí)驗(yàn)5: 以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式： 5’?UUC UUC UUC UUC UUC?3’或 5’?UCU UCU UCU UCU UCU?3’或 5'?CUU CUU CUU CUU CUU?3'分別產(chǎn)生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸為模板時(shí)也可能只合成2種多肽：5’?GUA GUA GUA GUA GUA?3’或5’?UAG UAG UAG UAG UAG?3’ 或5’?AGU AGU AGU AGU AGU?3’由第二種讀碼方式產(chǎn)生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產(chǎn)生GUA（Val）或AGU（Ser）。實(shí)驗(yàn)6: 以隨機(jī)多聚物指導(dǎo)多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機(jī)的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時(shí)可出現(xiàn)8種三聯(lián)子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多肽。 （3）氨基酸的“活化”與核糖體結(jié)合技術(shù)。 如果把氨基酸與ATP和肝臟細(xì)胞質(zhì)共培養(yǎng)，氨基酸就會(huì)被固定在某些熱穩(wěn)定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。現(xiàn)將氨基酸活化后的產(chǎn)物稱為氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應(yīng)液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相對(duì)分子質(zhì)量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結(jié)合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結(jié)合與未結(jié)合的AA-tRNA分開。 當(dāng)體系中帶有多聚核苷酸模板時(shí)，從大腸桿菌中提取的核糖體經(jīng)常與特異性氨基酰-tRNA相結(jié)合。如果把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時(shí)與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結(jié)合。 4種核苷酸組成61個(gè)編碼氨基酸的密碼子和3個(gè)終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對(duì)，但能被終止因子或釋放因子識(shí)別，終止肽鏈的合成。由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。 三．密碼子和反密碼子的相互作用 蛋白質(zhì)生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對(duì)與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據(jù)立體化學(xué)原理提出擺動(dòng)假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個(gè)以上同源密碼子的配對(duì)問題。Wobble hypothesis ① 任意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應(yīng)堿基形成Watson-Crick堿基配對(duì)。 ② 反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能識(shí)別一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能識(shí)別兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine（I）作為反密碼子第一位時(shí)，能識(shí)別三個(gè)密碼子。 ③ 如果數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自的tRNA。 ④ 根據(jù)上述規(guī)則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個(gè)密碼子。 四．tRNA tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個(gè)三聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點(diǎn)和A位點(diǎn)結(jié)合，此時(shí)，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子：反密碼子的配對(duì)與mRNA相結(jié)合，而其3’末端恰好將所轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，所有tRNA均專一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。 1、tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu) 受體臂（acceptor arm）主要由鏈兩端序列堿基配對(duì)形成的桿狀結(jié)構(gòu)和3’端末配對(duì)的3-4個(gè)堿基所組成，其3’端的最后3個(gè)堿基序列永遠(yuǎn)是CCA，最后一個(gè)堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨?；?。TφC臂是根據(jù)3個(gè)核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。反密碼子臂是根據(jù)位于套索中央的三聯(lián)反密碼子命名的。D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常見的tRNA分子有76個(gè)堿基，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個(gè)核苷酸不等，tRNA分子長(zhǎng)度的不同主要是由其中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對(duì)于維持反密碼子環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。2．tRNA的L形三級(jí)結(jié)構(gòu) 酵母和大腸桿菌tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)都呈L形折疊式。這種結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AA-tRNA合成酶的識(shí)別有關(guān)。受體臂和TφC臂的桿狀區(qū)域構(gòu)成了第一個(gè)雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了第二個(gè)雙螺旋。 tRNA的L形高級(jí)結(jié)構(gòu)反映了其生物學(xué)功能，因?yàn)樗纤\(yùn)載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以兩個(gè)不同的功能基團(tuán)最大限度分離。3．tRNA的功能 轉(zhuǎn)錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉(zhuǎn)移至另一種結(jié)構(gòu)上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對(duì)。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機(jī)制。4．tRNA的種類 （1）起始tRNA和延伸tRNA 能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識(shí)別。（3）校正tRNA 校正tRNA分為無(wú)義突變及錯(cuò)義突變校正。在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱為無(wú)義突變。 五．AA-tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反應(yīng)式如下： 它實(shí)際上包括兩步反應(yīng)： 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨?；D(zhuǎn)移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結(jié)合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP 蛋白質(zhì)合成的真實(shí)性主要決定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸與對(duì)應(yīng)的tRNA相結(jié)合。AA-tRNA合成酶既要能識(shí)別tRNA，又要能識(shí)別氨基酸，它對(duì)兩者都具有高度的專一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結(jié)構(gòu)，容易被tRNA合成酶所識(shí)別，困難的是這些酶如何識(shí)別結(jié)構(gòu)上非常相似的氨基酸。 有兩道關(guān)口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖體像一個(gè)能沿mRNA模板移動(dòng)的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。它是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)，在未成熟的蟾蜍卵細(xì)胞內(nèi)則高達(dá)1012。核糖體和它的輔助因子為蛋白質(zhì)合成提供了必要條件。 1.核糖體的組成 原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質(zhì)組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質(zhì)占2/5。核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的rRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。 大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1??S21表示，大亞基由33種蛋白質(zhì)組成，分別用L1??L33表示。真核生物細(xì)胞核糖體大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)。 2、rRNA 3.核糖體的功能 核糖體包括至少5個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）、結(jié)合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心），此外還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。小亞基上擁有mRNA結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)序列特異的識(shí)別過程，如起始位點(diǎn)的識(shí)別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負(fù)責(zé)氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合等。A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。 核糖體可解離為亞基或結(jié)合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成70S/80S顆粒，繼續(xù)翻譯進(jìn)程。體外反應(yīng)體系中，核糖體的解離或結(jié)合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時(shí)，70S解離為亞基，濃度達(dá)10-2mol/L時(shí)則形成穩(wěn)定的70S顆粒。細(xì)胞中大多數(shù)核糖體處于非活性的穩(wěn)定狀態(tài)，單獨(dú)存在，只有少數(shù)與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼子，至終止子時(shí)合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長(zhǎng)短而定，一般40個(gè)核苷酸有一個(gè)核糖體。 七.信使核糖核酸 mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過三聯(lián)子密碼翻譯生成蛋白質(zhì)，其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)是不同的。 八、蛋白質(zhì)的生物合成 核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過程。蛋白質(zhì)合成消耗了細(xì)胞中90%左右用于生物合成反應(yīng)的能量。細(xì)菌細(xì)胞中的2萬(wàn)個(gè)核糖體，10萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)因子和20萬(wàn)個(gè)tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個(gè)100個(gè)氨基酸的多肽只需5分鐘。 1.蛋白質(zhì)生物合成的主要步驟： 翻譯的起始——核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，導(dǎo)致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。主要分為五步 1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步 ① Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.② Peptide bond formation.③ Translocation.2.與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的因子 起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1 識(shí)別 UAA和UAG;RF-2 識(shí)別 UAA和UGA;RF-3 僅能促進(jìn)RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時(shí)需要GTP。真核生物中只有一個(gè)RF，能識(shí)別3個(gè)終止子。 3、蛋白質(zhì)合成的起始 蛋白質(zhì)合成的起始復(fù)合物: 30S 核糖體小亞基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖體大亞基 Mg2+ 合成的起始可分為三步: 1、30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF-3相結(jié)合，誘發(fā)模板mRNA與小亞基結(jié)合。 2、由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所組成的復(fù)合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結(jié)合。反密碼子與密碼子配對(duì)。 3、上述六組分復(fù)合物再與50S大亞基結(jié)合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個(gè)起始因子。 表27-9 真核細(xì)胞中參與翻譯起始的蛋白質(zhì)因子及其功能 真核因子 功能 eIF2 促進(jìn)Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結(jié)合。 eIF2B eIF3 是最早與核糖體40S小亞基結(jié)合的促進(jìn)因子，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的正常進(jìn)行。 eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級(jí)結(jié)構(gòu)并使之與40S小亞基結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF4B 與mRNA模板相結(jié)合，協(xié)助核糖體掃描模板序列，定位AUG。 eIF4E 與mRNA 5'的帽子結(jié)構(gòu)相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。eIF4G 與eIF4E和poly（A）結(jié)合蛋白（PAB）相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF5 促使多個(gè)蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結(jié)合形成80核糖體，形成翻譯起始復(fù)合物。 eIF6 促進(jìn)沒有蛋白質(zhì)合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個(gè)亞基。 4、肽鏈的延伸 肽鏈延伸的基本要求是 ： 有完整的起始復(fù)合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。 肽鏈延伸也可被分為三步： 第一步，與新進(jìn)來的氨基酰-tRNA相結(jié)合。氨基酰-tRNA首先必須與GTP-EF-Tu復(fù)合物相結(jié)合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復(fù)合物并與70S中的A位點(diǎn)相結(jié)合。此時(shí)，GTP水解并釋放GDP-EF-Tu復(fù)合物。 第二步，肽鍵形成。肽鍵形成之初，兩個(gè)氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結(jié)合，仍然分別位于A位點(diǎn)和P位點(diǎn)上。A位點(diǎn)上的氨基酸（第二個(gè)氨基酸）中的α-氨基作為親核基團(tuán)取代了P位點(diǎn)上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團(tuán)形成肽鍵。本反應(yīng)可能由peptidyl transferase 催化。 第三步，移位（translocation）。核糖體向mRNA的3’方向移動(dòng)一個(gè)密碼子，使得帶有第二個(gè)氨基酸（現(xiàn)已成為二肽）的tRNA從A位進(jìn)入P位，并使第一個(gè)tRNA從P位進(jìn)入E位。此時(shí)模板上的第三個(gè)密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。 5、肽鏈的終止 當(dāng)終止密碼子進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)時(shí)，在釋放因子RF1-3的作用下： （1）水解末端肽基tRNA；（2）釋放新生肽和tRNA； （3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個(gè)亞基。 6、蛋白質(zhì)合成的抑制劑 抗菌素對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結(jié)合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯(cuò)讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制蛋白質(zhì)合成。 鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，并導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會(huì)摻入。對(duì)鏈霉素敏感位點(diǎn)在30S亞基上。 嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進(jìn)入。它所帶的氨基與AA-tRNA上的氨基一樣，能與生長(zhǎng)中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。 青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)，后兩種則很少在醫(yī)學(xué)上使用。 -------- 第四講 DNA、RNA和蛋白質(zhì)代謝 DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控制了細(xì)胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能夠得到表達(dá)。DNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。 RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜；RNA既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。 蛋白質(zhì)是生物信息通路上的終產(chǎn)物，一個(gè)活細(xì)胞在任何發(fā)育階段都需要數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。因此，活細(xì)胞內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著各種蛋白質(zhì)的合成、修飾、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解反應(yīng)。 一、核苷酸的合成與代謝 核苷酸是DNA和RNA的前體是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)能流通領(lǐng)域中的載體（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP還是第二信使。 1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate） 這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻(xiàn)一個(gè)氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。 其次，把甘氨酸中的三個(gè)基團(tuán)加到PRA上。第三，由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第四，谷氨酰胺提供另一個(gè)N。第五，脫水環(huán)化形成咪唑環(huán)。第六，羧基化 第七，通過分子重排將羧基從咪唑第4碳的環(huán)外氨基上轉(zhuǎn)移到第5位碳原子上。第八-九，由天門冬酰胺把另一個(gè)氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第十一，脫水環(huán)化，形成嘌呤IMP。 參與合成AMP的是①腺苷琥珀酸合成酶和②腺苷琥珀酸裂解酶。參與合成GMP的是③IMP脫氫酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶。 2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調(diào)節(jié) 3．嘧啶核苷酸是由天門冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的 嘧啶從頭合成途徑不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶環(huán)首先被合成，然后才與核糖-5-磷酸相連。這個(gè)反應(yīng)需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4．核苷單磷酸轉(zhuǎn)化為核苷三磷酸 反應(yīng)生成的ADP可通過糖酵解酶或氧化磷酸化途徑被進(jìn)一步磷酸化。ATP能夠把磷酸基團(tuán)加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。 核苷二磷酸可通過一個(gè)公用的核苷二磷酸激酶被進(jìn)一步磷酸化生成核苷三磷酸。 5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。所有dNTP都直接來自于NTP（其實(shí)是NDP）。這個(gè)反應(yīng)很特殊，因?yàn)楹颂巧系倪€原反應(yīng)發(fā)生于一個(gè)沒有活化的碳原子上。催化該反應(yīng)的酶是核糖核苷酸還原酶。 大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學(xué)活性和底物特異性同時(shí)受效應(yīng)子（effector molecules）的影響。每個(gè)R1亞基上都有兩個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，當(dāng)影響整體酶活性的那個(gè)位點(diǎn)與ATP相結(jié)合時(shí)，酶活性增加；而當(dāng)它與dATP結(jié)合時(shí)，酶活性消失。 第二個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)控制了底物特異性。當(dāng)dATP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，UDP和CDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。當(dāng)dTTP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，GDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。核糖核苷酸還原反應(yīng)的主要過程 1.還原酶R2亞基處于氧化態(tài)-X˙，向核糖3'位碳原子上的H發(fā)起攻擊，生成3'位自由基。2.R1亞基上的-SH基團(tuán)為2'-OH提供一個(gè)H原子，使之生成-OH2基團(tuán)。3.脫水后，3'位自由基幫助維持2'位O+基團(tuán)。 4.R1亞基上的另一個(gè)-SH基團(tuán)為2'-CH+提供一個(gè)H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亞基上的X-H發(fā)起攻擊。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）來自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP；反應(yīng)中的甲基來自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。 7、嘌呤和嘧啶降解后分別生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解 第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團(tuán)，由Adenosine-monophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。 二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine； 三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine； 四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine； 五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代謝突變會(huì)引起重要疾病。 如人體內(nèi)缺失adenosine deaminase，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的免疫缺失性疾病，因?yàn)榇藭r(shí)T-淋巴和B-淋巴細(xì)胞不能正常發(fā)育。AD缺失后，細(xì)胞內(nèi)dATP的含量將高達(dá)正常細(xì)胞中的100倍，而過量的dATP則抑制了其余dNTP在T-淋巴細(xì)胞中的合成。許多化療（chemotherapy）藥劑都針對(duì)核苷酸合成途徑。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。 胸苷合成中的主要抑制劑有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基葉酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制劑，但它在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為FdUMP以后，就能直接與TS相結(jié)合并使之失活。氨甲基葉酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制劑，氨甲基葉酸與該酶的親和力比底物dihydrofolate高100倍。 二、氨基酸代謝 按所占的質(zhì)量比例計(jì)算，N在生物體內(nèi)的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有機(jī)氮，被結(jié)合于氨基酸或核苷酸分子中。地球上的動(dòng)植物共含氮約1.5×1010t，而每年通過硝化細(xì)菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥廠每年生產(chǎn)的化肥僅含氮約108t，所以，如果沒有生物固氮，生命很快就不復(fù)存在了。 1.銨通過谷氨酸→谷氨酰胺被結(jié)合到有機(jī)物質(zhì)中。主要有兩步反應(yīng)： ⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 總結(jié)： Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+ 因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調(diào)控位點(diǎn)。 在大腸桿菌中，GS由12個(gè)相同的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過構(gòu)象變化，也能通過共價(jià)修飾的方式得到調(diào)節(jié)。Alanine，Glycine和其它至少6種gln代謝產(chǎn)物都是GS活性的變構(gòu)抑制劑，每個(gè)抑制劑都只有部分抑制作用。除變構(gòu)抑制之外，GS活性還受共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)?97位酪氨酸被腺苷化后（加上AMP），該酶更容易受變構(gòu)抑制劑的反饋調(diào)節(jié)。2.氨基酸的生物合成 高等動(dòng)物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)表22-1 氨基酸合成的六條主要途徑 3.氨基酸脫羧基化后生成有機(jī)胺。許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)都是胺或其次生代謝產(chǎn)物。Tyrosine降解產(chǎn)物有dopamine（多巴胺），epinephrine（腎上腺素），norepinephrine，統(tǒng)稱為Catecholamines（兒茶酚胺）。 4.精氨酸降解產(chǎn)生NO˙(Nitric Oxide)。 本世紀(jì)80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)NO是人體內(nèi)重要的信號(hào)分子，它參與神經(jīng)傳遞、凝血和血壓調(diào)控等一系列生理反應(yīng)。雖然它是氣體，極易擴(kuò)散，但由于它十分活躍，其擴(kuò)散半徑一般只有1mm。 三、氨基酸及功能蛋白質(zhì)合成后的修飾 1.蛋白質(zhì)剛剛被合成時(shí)，都以fMet（原核）或Met（真核）開始，多肽合成后，N端的formyl group、Met殘基，有時(shí)還包括N揣多個(gè)殘基或C端的殘基都會(huì)被切除。50%的真核蛋白中，N-端殘基的氨基酸會(huì)被N-乙基化。 2.切除信號(hào)肽。許多蛋白質(zhì)都帶有15-30個(gè)殘基的signal peptides，負(fù)責(zé)指導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的精確定位。 3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化 5.氨基酸的異戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白質(zhì)還要與輔基(prosthetic groups)相結(jié)合； Cytochrome C只有與血紅素（heme）相結(jié)合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常與Biotin分子相結(jié)合。有些蛋白質(zhì)必須經(jīng)蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質(zhì)只有在形成二硫鍵之后才有功能。 四、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和降解 1、絕大部分被運(yùn)入ER內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)Signal peptide。該序列常常位于蛋白質(zhì)的氨基末端，長(zhǎng)度一般在13-36個(gè)殘基之間，有三個(gè)特點(diǎn)：（1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸；（2）常常在靠近該序列N-端疏水氨基酸區(qū)上游帶有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（Ala或Gly）。 研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽把Ribosome牽引到ER上。蛋白質(zhì)合成之初，一旦信號(hào)肽序列的N端暴露在核糖體外，該序列（包括核糖體）就迅速與SRP（signal recognition particle）相結(jié)合，誘發(fā)SRP與GTP相結(jié)合，停止新生肽的進(jìn)一步延伸（此時(shí)新生肽一般長(zhǎng)約70個(gè)殘基左右）。受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牽引，這個(gè)復(fù)合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠攏，并通過peptide transport complex進(jìn)入ER內(nèi)腔。 5.Rough ER上的蛋白質(zhì)常常通過運(yùn)轉(zhuǎn)載體將經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)送入高爾基體，再分別送到各個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)。 6.蛋白質(zhì)中的核定位序列一般不被切除。 蛋白質(zhì)的核定位是通過多個(gè)蛋白的共同作用來實(shí)現(xiàn)的。Importin(α,β亞基)的作用有點(diǎn)像SRP受體。NLS蛋白-Importin復(fù)合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通過核孔。 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在類似的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)。 7、蛋白質(zhì)降解是一個(gè)有序的過程。 在大腸桿菌中，許多蛋白質(zhì)的降解是通過一個(gè)依賴于ATP的蛋白酶（稱為L(zhǎng)on）來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中存在有錯(cuò)誤或半衰期很短的蛋白質(zhì)時(shí)，該蛋白酶就被激活。每切除一個(gè)肽鍵要消耗兩分子ATP。 在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解需要Ubiquitin，一個(gè)有76個(gè)氨基酸殘基組成極為保守的蛋白參與。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個(gè)依賴于ATP的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（Proteasome，Mr.1×106）。 成熟多肽N-端第一個(gè)殘基對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有重要影響。 五、DNA代謝 無(wú)論是只含有一對(duì)染色體的原核細(xì)胞還是帶有多對(duì)染色體的真核細(xì)胞，只有整個(gè)基因組得到了完整準(zhǔn)確的復(fù)制，細(xì)胞分裂才能順利發(fā)生。所以說，DNA復(fù)制的起始，標(biāo)志了細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)新的周期。㈠、DNA復(fù)制 根據(jù)反應(yīng)階段和所需的不同酶類，DNA的復(fù)制可被分為三個(gè)階段，即復(fù)制起始、延伸和終止。每個(gè)DNA復(fù)制的獨(dú)立單元被稱為復(fù)制子（replicon），主要包括復(fù)制起始位點(diǎn)（Origine of replication）和終止位點(diǎn)（terminus）。原核生物的整個(gè)染色體上一般只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。大腸桿菌DNA的復(fù)制需要有20種左右的酶和蛋白質(zhì)因子參與，整個(gè)DNA復(fù)制機(jī)器被稱之為DNA replicase system或replisome。 Helicase，任何DNA在被復(fù)制前都必須解開雙鏈，這個(gè)過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。 Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產(chǎn)生的扭曲力。DNA結(jié)合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Primases，為DNA復(fù)制提供RNA引物。 DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。 DNA Ligases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯鍵。1.DNA復(fù)制的起始 大腸桿菌中的復(fù)制起始位點(diǎn)是Ori C，全長(zhǎng)245Bp，該序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)中都是保守的。 DNA復(fù)制起始中的主要步驟 a.大約20個(gè)左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個(gè)9堿基重復(fù)區(qū)相結(jié)合； b.識(shí)別并使3個(gè)13堿基串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開環(huán)結(jié)構(gòu)； c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個(gè)DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時(shí)起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時(shí)，DnaB的解鏈效率非常高。 整個(gè)DNA復(fù)制過程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控?！監(jiān)nce in each cell cycle。“ DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個(gè)GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說來，256bp才應(yīng)有一個(gè)GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時(shí)，oriC與細(xì)胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過程調(diào)控，因?yàn)镈naA只有與ATP相結(jié)合時(shí)才能與oriC區(qū)DNA相結(jié)合。2.DNA子鏈的延伸 主要包括兩個(gè)不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。 前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點(diǎn)附近合成一個(gè)10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。 滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補(bǔ)上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個(gè)片段相連。3.DNA鏈的終止 當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個(gè)20bp序列）時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個(gè)陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復(fù)合物（ter utilization substance）來完成的。4.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更復(fù)雜 真核生物的origin of replication被稱為ARS-autonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長(zhǎng)約150dp，有多個(gè)保守重復(fù)區(qū)，共有約500個(gè)replicators分布于酵母的17條染色體中。 ㈡、DNA的損傷修復(fù) 1． 錯(cuò)配修復(fù)（mismatch Repair） 錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá)102-103，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。 2.堿基切除修復(fù)（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特異性識(shí)別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic）。細(xì)胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excision repair） 當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無(wú)法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)。 4.DNA的直接修復(fù)（Direct repair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座 DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)”轉(zhuǎn)座“這一命名并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來位置上，在新位點(diǎn)上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。1． 轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征 a.簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個(gè)IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。 b.復(fù)合式轉(zhuǎn)座子（composite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨(dú)移動(dòng)，因?yàn)樗鼈兊墓δ鼙恍揎椓耍荒茏鳛閺?fù)合體移動(dòng)。 2、轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制 轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長(zhǎng)度不同，但對(duì)于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長(zhǎng)度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對(duì)的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。3.轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng) ① 轉(zhuǎn)座引起插入突變;② 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因;③ 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變;④ 轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.六、RNA代謝 除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA。基因組DNA通過一個(gè)被稱為轉(zhuǎn)錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換到與模板DNA鏈相互補(bǔ)的RNA單鏈上。 mRNA，編碼了一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔?；rRNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。 1． 依賴于DNA的RNA合成 從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來說，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個(gè)主要不同點(diǎn)： A． 轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物； B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板； C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。 2.RNA合成的終止 一旦RNA聚合酶啟動(dòng)了基因轉(zhuǎn)錄，它就會(huì)沿著模板5'→3'方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到遇到終止信號(hào)時(shí)才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。研究RNA鏈終止時(shí)遇到最常見的問題是3'端核苷酸的定位，因?yàn)榛罴?xì)胞內(nèi)部根據(jù)終止信號(hào)正確終止的RNA與一個(gè)經(jīng)過剪接的RNA在3'端沒有兩樣，都是-OH基團(tuán)。模板DNA上都有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號(hào)--終止子，每個(gè)基因或操縱子都有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)終止子。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。 a.依賴于ρ因子的終止 ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。 有人認(rèn)為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。 b、不依賴于ρ 因子的終止 若終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。 3.RNA聚合酶II及轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子上的裝配 TFⅡH還參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄過程中碰到受損傷的核苷酸時(shí)，TFⅡH能及時(shí)啟動(dòng)核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。 Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 4.RNA的加工成熟 所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結(jié)構(gòu)；3’加多聚A；切除內(nèi)含子。 在Group I內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3'-OH 作為親核基團(tuán)向Intron 5'的磷酸二酯鍵發(fā)起進(jìn)攻。 Group II內(nèi)含子切除體系 核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。 ----------------------------- 第五講 分子生物學(xué)研究法 一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題； 3.50年代末至60年代，相繼提出了”中心法則“和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。年份 事 件 1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。 1944 O.T.Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 A.D.Hershey和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。 1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。 1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 1959-1960 S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。 1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。 1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由”質(zhì)?！癉NA所決定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體φ174基因組測(cè)定。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。 1980 美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。 1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。 1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。 1988 J.D.Watson出任”人類基因組計(jì)劃“首席科學(xué)家。 1989 DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧--”O(jiān)ncomouse“。 1992 歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定(315kb)1994 第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。 1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測(cè)定。 1997 英國(guó)愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。 基因工程中常見的名詞: 遺傳工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重組DNA技術(shù)--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。基因工程的主要內(nèi)容或步驟: 1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。 2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。 3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。 4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。 5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 二、基因操作的主要技術(shù)原理 1． 核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。 在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。 在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術(shù) :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis 2． 核酸的分子雜交技術(shù) 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地”吸印“ 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟： 將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)； 將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3． 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（Competent Cells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。對(duì)絕大多數(shù)hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。4． DNA序列分析 a.Sanger的雙脫氧鏈終止法 Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下： ①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無(wú)5'→3'外切酶活性。b． Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué))該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。 該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)： 堿基的特異性修飾； 被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移； 失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。 專門用來對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。 c． DNA序列分析自動(dòng)化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。 d.DNA雜交測(cè)序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段較短的DNA探針能與較長(zhǎng)的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種探針會(huì)與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。 當(dāng)靶DNA與標(biāo)記探針形成G-T或G-A末端堿基錯(cuò)配的雙鏈體時(shí)，檢測(cè)有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。但是，探針短，雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降，信/噪比下降，影響結(jié)果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測(cè)定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的應(yīng)用： ① 可有效檢測(cè)靶DNA中的單堿基突變； ② 可用于不同DNA片段之間的序列比較； ③ 可用于檢測(cè)不同生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況； ④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。 5． 基因的定點(diǎn)誘變（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 a.盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。 b．寡核苷酸引物誘變 應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。 C．PCRG與PCR誘變 6． 利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(yàn)(DNA mobility shift assay--EMSA)。 b． DNase I 印跡試驗(yàn)（DNase I foot printing） 主要步驟： ① 用32P標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端； ② 加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育； ③ 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。 這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂?、艹恋鞤NA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）； ⑤進(jìn)行DNA凝膠分析。 如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。 c． 甲基化干擾試驗(yàn)(Methylation interference assay) 用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個(gè)G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩試驗(yàn)。分離各種DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個(gè)G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，那么，六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA中觀察到。 d． 體內(nèi)足跡試驗(yàn) 用適量DMS處理完整的游離細(xì)胞，使染色質(zhì)中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對(duì)照的裸露DNA經(jīng)甲基化處理后形成的梯度相對(duì)照，就能發(fā)現(xiàn)DNA鏈上的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)。 三、分子克隆技術(shù) 1、高質(zhì)量mRNA的制備 應(yīng)用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated Oligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2． 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA； 應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）； 應(yīng)選用甲基化dCTP； 應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。 Super Script Choice cDNA合成系統(tǒng)中所用的poly（dT）引物 因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應(yīng)選用mcrA-mcrB-菌株。 3．分子克隆的主要方法 （1）構(gòu)建cDNA、核DNA文庫(kù)，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術(shù)；（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術(shù)； （4）差別分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system； （6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移（genomic DNA Walking）。 習(xí)慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。分子生物學(xué)上，把將外源DNA插入具有自主復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以自主復(fù)制和永久保存的過程叫做分子克隆。 文庫(kù)篩選與基因豐度有關(guān)。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細(xì)胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般在細(xì)胞中只有10-20個(gè)拷貝，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達(dá)到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個(gè)克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產(chǎn)生10萬(wàn)-60萬(wàn)個(gè)克隆子。 A.差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù) B.cRNA差式顯示法 除了極少數(shù)特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly(A)尾巴。 P.Liang等人設(shè)計(jì)合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。 DDRT-PCR的主要步驟： Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA； Ⅱ.用5'隨機(jī)引物和某個(gè)3'端錨定引物對(duì)擴(kuò)增第一鏈(摻入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA變性測(cè)序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測(cè)差別條帶； Ⅳ.回收特異性差別條帶； Ⅴ.用同一引物對(duì)擴(kuò)增已回收的DNA條帶； Ⅵ.用Northern，Southern及測(cè)序法分析所得的條帶； Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長(zhǎng)cDNA或核基因。 C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis) RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃復(fù)性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。 D.酵母雙雜交體系 Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結(jié)合域（BD），其C端768-881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，而此時(shí)，AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。 若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無(wú)法被激活,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的AD或BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。 主要實(shí)驗(yàn)過程： a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.構(gòu)建帶有GAL1 UAS-啟動(dòng)子-lac Z（His3）的轉(zhuǎn)化載體;c.把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫(kù)。 d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽(yáng)性菌落。 E.基因的圖位克隆法 Map-based cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。 二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。 三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。 通過對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計(jì)算的，1cm（厘米）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。 四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重復(fù)序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡(jiǎn)單的例子是用機(jī)械手把極微量（nanoliters）的DNA點(diǎn)到玻片或其它載體上，照射UV light使之永久固定，用不同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部全部已知基因分別點(diǎn)到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。 第六講 原核基因表達(dá)調(diào)控 原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測(cè)的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無(wú)保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個(gè)每30min增殖一倍的109細(xì)菌群體中，若有一個(gè)細(xì)菌變成了29.5min增殖一倍，大約經(jīng)過80天的連續(xù)生長(zhǎng)后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長(zhǎng)速度。 一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中約有2500-3000個(gè)基因。估計(jì)正常情況下，可帶有107個(gè)蛋白質(zhì)，平均每個(gè)基因產(chǎn)生3000多個(gè)蛋白質(zhì)分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個(gè)核糖體，有50余種核糖體結(jié)合蛋白，數(shù)量也很驚人。此外，負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導(dǎo)酶，其含量可少至每細(xì)胞僅1-5個(gè)分子。 一個(gè)體系在需要時(shí)被打開，不需要時(shí)被關(guān)閉。這種”開-關(guān)“（on-off）活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。當(dāng)我們說一個(gè)系統(tǒng)處于”off“狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成1或2個(gè)mRNA分子。所謂”關(guān)“實(shí)際的意思是基因表達(dá)量特別低，很難甚至無(wú)法檢測(cè)。 科學(xué)家把這個(gè)從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)(gene expression)，對(duì)這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation或gene control)。要了解動(dòng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必須弄清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： ① 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)； ② mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)； ③ 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA).原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 一、乳糖操縱子的調(diào)控模式 大腸桿菌乳糖操縱子(lactose operon)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先與啟動(dòng)區(qū)(promoter,P)結(jié)合，通過操縱區(qū)(operator,O)向右轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄從O區(qū)的中間開始，按Z→Y→A方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mRNA上都帶有這3個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。 Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 1． 酶的誘導(dǎo)-lac體系受調(diào)控的證據(jù) 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個(gè)大腸桿功細(xì)胞內(nèi)大約只有1-2個(gè)酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。 科學(xué)家把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S、無(wú)放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無(wú)35S標(biāo)記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。 已經(jīng)分離在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生lacmRNA的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：I型和O型。 I型：野生型為I+，突變型為I-O型：野生型為O+，突變型為Oc。 I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以I基因被稱為調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。研究發(fā)現(xiàn)，I基因是一個(gè)產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。I-突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為lac永久表達(dá)型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個(gè)正常阻遏物，使細(xì)胞中的lac仍然被抑制。 遺傳學(xué)圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個(gè)基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個(gè)位點(diǎn)或一個(gè)非編碼區(qū)域，而不是一個(gè)基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久型合成，O區(qū)域稱為操縱基因。 2.操縱子模型 Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，因此選為突破口，終于通過大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了該操縱子的控制模型。 ① Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。 ② 這個(gè)mRNA分子的啟動(dòng)子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動(dòng)子區(qū)（P），不能單獨(dú)起動(dòng)合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。③ 操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。④當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。 ⑤誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動(dòng)子能夠順利起始mRNA的合成。 3.Lac操縱子的本底水平表達(dá) 因?yàn)檎T導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而運(yùn)轉(zhuǎn)誘導(dǎo)物需要透過酶。在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量（1-5個(gè)mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。 4.葡萄糖對(duì)lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應(yīng) 研究表明，葡萄糖對(duì)lac操縱子表達(dá)的抑制作用是間接的，因?yàn)榇嬖谝环N大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導(dǎo)合成lac mRNA。 5.cAMP與代謝物激活蛋白 當(dāng)葡萄糖和乳糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，lac啟動(dòng)子表達(dá)受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當(dāng)葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導(dǎo)，一度停止生長(zhǎng)的細(xì)胞又恢復(fù)分裂。如果將細(xì)菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)菌中的cAMP濃度就會(huì)很低；如果將細(xì)菌置于甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解的碳源培養(yǎng)基中，細(xì)菌中cAMP的濃度也會(huì)很高。 研究證實(shí)，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是該代謝物降低了細(xì)胞中cAMP的含量.事實(shí)上，cAMP-CAP復(fù)合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。 cAMP-CAP不但能與DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個(gè)”環(huán)"的亞基存在，lacI+基因產(chǎn)物（阻遏物）無(wú)法與O區(qū)相結(jié)合lac operon得到表達(dá)。 6.lac操縱子DNA的調(diào)控區(qū)域--P.O.區(qū) lac P（啟動(dòng)子區(qū)）從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)止，共長(zhǎng)82bp（-82～+1）O區(qū)就是阻遏物結(jié)合區(qū)，位于P區(qū)后半部分和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（-7～+28），該區(qū)序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱中心點(diǎn)在+11位。P區(qū)的CAMP-CAP結(jié)合區(qū)（-67～-52）也有對(duì)稱性，其對(duì)稱位點(diǎn)在-60～-59之間。 在一個(gè)完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1:0.5:0.2，這個(gè)比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。 ①lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。這種現(xiàn)象發(fā)生的頻率取決于每一個(gè)后續(xù)的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。②在lac mRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因? 分子生物學(xué)課程教學(xué)講義 朱玉賢 第一講 序論 二、現(xiàn)代分子生物學(xué)中的主要里程碑 分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動(dòng) 地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。當(dāng)人們意識(shí)到同一生物不同世代之間的連續(xù)性是由生物體自身所攜帶的遺傳物質(zhì)所決定的，科學(xué)家為揭示這 些遺傳密碼所進(jìn)行的努力就成為人類征服自然的一部分，而以生物大分子為研究對(duì)像的分子生物學(xué)就迅速成為現(xiàn)代社會(huì)中最具活力的科學(xué)。 從1847年Schleiden和Schwann提出“細(xì)胞學(xué)說”，證明動(dòng)、植物都是由細(xì)胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時(shí)間，我們對(duì) 生物大分子--細(xì)胞的化學(xué)組成卻有了深刻的認(rèn)識(shí)。孟德爾的遺傳學(xué)規(guī)律最先使人們對(duì)性狀遺傳產(chǎn)生了理性認(rèn)識(shí)，而Morgan的基因?qū)W說則進(jìn)一步將“性狀”與 “基因”相耦聯(lián)，成為分子遺傳學(xué)的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。在蛋白質(zhì)化 學(xué)方面，繼Sumner在1936年證實(shí)酶是蛋白質(zhì)之后，Sanger利用紙電泳及層析技術(shù)于1953年首次闡明胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了蛋白質(zhì)序列分析 的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術(shù)解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結(jié)構(gòu)，論證了 這些蛋白質(zhì)在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構(gòu)型的先驅(qū)。1910年，德國(guó)科學(xué)家Kossel第一個(gè)分離了腺嘌呤，胸腺嘧啶和組氨酸。 1959年，美國(guó)科學(xué)家Uchoa第一次合成了核糖核酸，實(shí)現(xiàn)了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。同年，Kornberg實(shí)現(xiàn)了試管內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞中DNA的復(fù)制。 1962年，Watson（美）和Crick（英）因?yàn)樵?953年提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后者通過X射線衍射證實(shí)了Watson-Crick模型。 1965年，法國(guó)科學(xué)家Jacob和Monod提出并證實(shí)了操縱子（operon）作為調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞代謝的分子機(jī)制。此外，他們還首次推測(cè)存在一種與DNA序列相互補(bǔ)、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所（細(xì)胞質(zhì)）并翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRNA（信使核糖核酸）。 1972年，Paul Berg（美）第一次進(jìn)行了DNA重組。 1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次進(jìn)行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)遺傳因子（jumping gene或稱mobile element）而獲得Nobel獎(jiǎng)。 1993年，美國(guó)科學(xué)家Roberts和Sharp因發(fā)現(xiàn)斷裂基因（introns）而獲得Nobel獎(jiǎng)。Mullis由于發(fā)明PCR儀而與加拿大學(xué)者Smith（第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變）共享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。 此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人關(guān)于致病力強(qiáng)的光滑型（S型）肺炎鏈球菌DNA導(dǎo)致致病力弱的粗糙型（R型）細(xì)菌發(fā)生遺 傳轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)；Hershey和Chase（1952）關(guān)于DNA是遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)；Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律（即中心法則）: Meselson和Stahl（1958）關(guān)于DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)以及Yanofsky和Brener（1961）年關(guān)于遺傳密碼三聯(lián)子的設(shè)想都為分 子生物學(xué)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。 我國(guó)生物科學(xué)家吳憲20世紀(jì)20年代初回國(guó)后在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影 響的研究，成為我國(guó)生物化學(xué)界的先驅(qū)。20世紀(jì)60年代、70年代和80年代，我國(guó)科學(xué)家相繼實(shí)現(xiàn)了人工全合成有生物學(xué)活性的結(jié)晶牛胰島素，解出了三方二 鋅豬胰島素的晶體結(jié)構(gòu)，采用有機(jī)合成與酶促相結(jié)合的方法完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜結(jié)構(gòu)與功能等方面都有 世所矚目的建樹。 三、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容 所有生物體中的有機(jī)大分子都是以碳原子為核心，并以共價(jià)鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構(gòu)成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機(jī)大分子都是由完全相 同的單體，如蛋白質(zhì)分子中的20種氨基酸、DNA及RNA中的8種堿基所組合而成的，由此產(chǎn)生了分子生物學(xué)的3條基本原理: 1.構(gòu)成生物體有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是相同的； 2.生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的建成都遵循著各自特定的規(guī)則； 3.某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容: DNA重組技術(shù)------基因工程 基因表達(dá)調(diào)控-------核酸生物學(xué) 生物大分子結(jié)構(gòu)功能----結(jié)構(gòu)分子生物學(xué) DNA重組技術(shù)（又稱基因工程） 這是20世紀(jì)70年代初興起的技術(shù)科學(xué)，目的是將不同DNA片段（如某個(gè)基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí) 復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。嚴(yán)格地說，DNA重組技術(shù)并不完全等于基因工程，因?yàn)楹笳哌€包括其他可能使生物細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)得到改造 的體系。DNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、酶工程及微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)長(zhǎng)期深入研究的結(jié)晶，而限制性內(nèi)切酶DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)與 應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。DNA重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景 NA 重組技術(shù)可用于定向改造某些生物基因組結(jié)構(gòu)，使它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價(jià)值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重組技術(shù)還被用來進(jìn)行基礎(chǔ)研究。如果說，分子生物學(xué)研究的核心是遺傳信息的傳遞和控制，那么根據(jù)中心法則，我們要研究的就是從 DNA到RNA，再到蛋白質(zhì)的全過程，也即基因的表達(dá)與調(diào)控。在這里，無(wú)論是對(duì)啟動(dòng)子的研究（包括調(diào)控元件或稱順式作用元件），還是對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分 析，都離不開重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。 基因表達(dá)調(diào)控研究 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子參與并控制了細(xì)胞的一切代謝活動(dòng)，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時(shí)序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列，所 以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時(shí)序發(fā)生變化（時(shí)序調(diào)節(jié)），并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以 修正（環(huán)境調(diào)控）。 原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)都比真核生物簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時(shí)間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻 譯過程在時(shí)間和空間上都被分隔開，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復(fù)雜的信息加工過程，其基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同的水平上。基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號(hào)傳 導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及RNA剪輯3個(gè)方面。 轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。 真核基因在結(jié)構(gòu)上的不連續(xù)性是近10年來生物學(xué)上的重大發(fā)現(xiàn)之一。當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之 外，還要將隔開各個(gè)相鄰編碼區(qū)的內(nèi)含子剪去，使外顯子（編碼區(qū)）相連后成為成熟mRNA。研究發(fā)現(xiàn)，有許多基因不是將它們的內(nèi)含子全部剪去，而是在不同的 細(xì)胞或不同的發(fā)育階段有選擇地剪接其中部分內(nèi)含子，因此生成不同的mRNA及蛋白質(zhì)分子。 結(jié)構(gòu)分子生物學(xué) 生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究（又稱結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）一個(gè)生物大分子，無(wú)論是核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提:首先，它擁有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）；其次，在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過程中必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。 結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。它包括結(jié)構(gòu)的測(cè)定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)變化規(guī)律的探索及結(jié)構(gòu)與功能相互 關(guān)系的建立3個(gè)主要研究方向。最常見的研究三維結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動(dòng)規(guī)律的手段是X射線衍射的晶體學(xué)（又稱蛋白質(zhì)晶體學(xué)），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液 相結(jié)構(gòu)，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。 --- 第二講 染色體與DNA 一、DNA的組成與結(jié)構(gòu) Avery在1944年的研究報(bào)告中寫道:“當(dāng)溶液中酒精的體積達(dá)到9/10時(shí)，有纖維狀物質(zhì)析出。如稍加攪拌，它就會(huì)象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶 液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質(zhì)并重復(fù)數(shù)次，可提高其純度。這一物質(zhì)具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它很可能就是DNA（誰(shuí)能想 到！）”。對(duì)DNA分子的物理化學(xué)研究導(dǎo)致了現(xiàn)代生物學(xué)翻天覆地的革命，這更是Avery所沒有想到。 所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。核苷酸序列對(duì)DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有很大影響，如B-DNA 中多聚（G-C）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復(fù)的DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級(jí)結(jié) 構(gòu)，它主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在，其基本特點(diǎn)是: 1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的。 2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。 3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對(duì)的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系叫堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。組成DNA分子 的堿基雖然只有4種，它們的配對(duì)方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多 核苷酸鏈有100個(gè)不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。 二、DNA聚合酶與DNA的合成 The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意義及成分分析 早在1928年英國(guó)科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒性（致病力）是由細(xì)胞表面莢膜中的多糖所決定的。具 有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因?yàn)閹в星v膜多糖而都能使小鼠發(fā)病，而具有粗糙外表的R型因?yàn)闆]有莢膜多糖而失去致病力（莢膜多糖能保護(hù)細(xì)菌免受運(yùn)動(dòng)白細(xì)胞攻 擊）。 首先用實(shí)驗(yàn)證明基因就是DNA分子的是美國(guó)著名的微生物學(xué)家Avery。Avery等人將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細(xì) 菌自然喪失了致病能力。再用活的粗糙型細(xì)菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因?yàn)榇植谛图?xì)菌天然無(wú)致病力。當(dāng)他們將經(jīng)燒煮殺死的S型細(xì)菌和活的R型細(xì) 菌混合再感染小鼠時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠每次都死了。解剖死鼠，發(fā)現(xiàn)有大量活的S型（而不是R型）細(xì)菌。他們推測(cè)，死細(xì)菌中的某一成分棗轉(zhuǎn)化源（transforming principle）將無(wú)致病力的細(xì)菌轉(zhuǎn)化成病原細(xì)菌。 美國(guó)冷泉港卡內(nèi)基遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家Hershey和他的學(xué)生Chase在1952年從事噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。噬菌體專門寄生在細(xì)菌體內(nèi)。它的頭、尾外 部都有由蛋白質(zhì)組成的外殼，頭內(nèi)主要是DNA。噬菌體侵染細(xì)菌的過程可以分為以下5個(gè)步驟:1噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細(xì)菌表面；2噬菌體 通過尾軸把DNA全部注入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，噬菌體的蛋白質(zhì)外殼則留在細(xì)胞外面；3噬菌體的DNA一旦進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，它就能利用細(xì)菌的生命過程合成噬菌體自身的 DNA和蛋白質(zhì)；④新合成的DNA和蛋白質(zhì)外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；⑤子代噬菌體由于細(xì)菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細(xì) 菌。他們發(fā)現(xiàn)被感染的細(xì)菌中帶有70%的噬菌體DNA，但只帶有20%的噬菌體蛋白質(zhì)。子代噬菌體中帶有50%標(biāo)記的DNA，卻只有1%的標(biāo)記蛋白質(zhì)。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色體結(jié)構(gòu) DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬(wàn)個(gè)基因，一個(gè)細(xì)胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為genomes（基因 組）。如果設(shè)想將人體細(xì)胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個(gè)堿基大約只占1－5厘米，而一個(gè)2－3kb的基因只相當(dāng)于地球上一條數(shù)十米長(zhǎng)，數(shù)厘米寬的線段！ Genotype(基因型): The genetic constitution of a given organism(指某個(gè)特定生物體細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳物質(zhì))。 Phenotype(表現(xiàn)型): Visible property of any given organism(某個(gè)特定生物體中可觀察到的物理或生理現(xiàn)象)。 Mutations: 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。 六、染色體的組成1.染色質(zhì)和核小體 染色質(zhì)DNA的Tm值比自由DNA高，說明在染色質(zhì)中DNA極可能與蛋白質(zhì)分子相互作用；在染色質(zhì)狀態(tài)下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復(fù)制 和轉(zhuǎn)錄活性大大低于在自由DNA中的反應(yīng)；DNA酶I（DNaseI）對(duì)染色質(zhì)DNA的消化遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于對(duì)純DNA的作用。染色質(zhì)的電子顯微鏡圖顯示出由核小 體組成的念珠狀結(jié)構(gòu)，可以看到由一條細(xì)絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。 核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長(zhǎng)度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色 體中含3.3×109堿基對(duì)，其理論長(zhǎng)度應(yīng)是180cm，這么長(zhǎng)的DNA被包含在46個(gè)51μm長(zhǎng)的圓柱體（染色體）中，其壓縮比約為104。 2.染色體中的核酸組成 ⑴不重復(fù)序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復(fù)序列長(zhǎng)約750－2000dp，相當(dāng)于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的長(zhǎng)度。單拷貝基因通過基因擴(kuò)增仍可合成大量的蛋白質(zhì)，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個(gè)絲心蛋白mRNA，每個(gè)mRNA可存活4d，共合成105個(gè)絲 心蛋白，這樣，在幾天之內(nèi)，一個(gè)單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個(gè)絲心蛋白分子。 ⑵中度重復(fù)序列 這類重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。 非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，這些單位在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)約5000次。在卵細(xì)胞形成過程中 這些基因可進(jìn)行幾千次不同比例的復(fù)制，產(chǎn)生2×106個(gè)拷貝，使rDNA占卵細(xì)胞DNA的75%，從而使該細(xì)胞能積累1012個(gè)核糖體。 ⑶高度重復(fù)序列——衛(wèi)星DNA 這類DNA只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%—60%，由6—100個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)幾百萬(wàn)次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度 梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復(fù)序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶（峰）。 高等真核生物DNA無(wú)論從結(jié)構(gòu)還是功能看都極為復(fù)雜，以小鼠為例: 1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復(fù)序列，重復(fù)數(shù)十萬(wàn)到上百萬(wàn)次/genome。 2.總DNA的20％是重復(fù)數(shù)千次、長(zhǎng)約數(shù)百bp的中等重復(fù)序列。 3.總DNA的70％是不重復(fù)或低重復(fù)序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。 Centromere:是細(xì)胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質(zhì)與染色體的結(jié)合位點(diǎn)（attachment point），這種結(jié)合對(duì)于染色體對(duì)在子細(xì)胞中的有序和平均分配至關(guān)重要。在酵母中，centromere的功能單位長(zhǎng)約130 bp，富含AT 堿基對(duì)。在高等真核細(xì)胞中，centromere都是由長(zhǎng)約5－10 bp、方向相同的高度重復(fù)序列所組成。 Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精確重復(fù)序列所組成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n 其中X、Y一般為1－4，單細(xì)胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中>1500。染色體末端的線性重復(fù)序列不能被DNA polymarase 所準(zhǔn)確復(fù)制，它們一般在DNA復(fù)制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。 Alu（長(zhǎng)約300bp）是人類高度重復(fù)序列,因?yàn)樵撔蛄兄袔в蠥luI的識(shí)別序列而得名。數(shù)十萬(wàn)個(gè)Alu重復(fù)序列散布于整個(gè)人類基因組中，達(dá)到總序列的1－3％。Alu與其它高度重復(fù)序列共占人類DNA的10％以上。 3.染色體中的蛋白質(zhì) 染色體上的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。通?？梢杂?mol/L NaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4處理使組蛋白與DNA分開。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨 酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A、H2B介于兩者之間。⑴組蛋白的一般特性 進(jìn)化上的極端保守性。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列與豌豆序列相比只有兩個(gè)氨基酸的差異（豌豆H4中的異亮氨基酸60→纈氨酸60，精氨酸→賴氨酸）。H3的保守性也很大，鯉魚與小牛胸腺的H3只差一個(gè)氨基酸，小牛胸腺與豌豆H3只差4個(gè)氨基酸。 無(wú)組織特異性。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。 肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。例如，N端的半條鏈上凈電荷為+16，C端只有+3，大部分疏水基團(tuán)都分布在C端。 組蛋白的修飾作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 ⑵非組蛋白的一般特性 染色體上除了存在大約與DNA等量的組蛋白以外，還存在大量的非組蛋白。非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。 (3)幾類常見的非組蛋白 a.HMG蛋白（high mobility group protein）。這是一類能用低鹽（0.35mol/L NaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相對(duì)分子質(zhì)量較低的非組蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量都在3.0×104以下。b.DNA結(jié)合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部組蛋白和70%非組蛋白后，還有一部分蛋白必須用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白分子量較低，約占非組蛋白的20%，染色質(zhì)的8%。 七.原核與真核染色體DNA比較 原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因〔如rRNA基因〕是以多拷貝形式存在； 整個(gè)染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成； 幾乎每個(gè)基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對(duì)應(yīng)狀態(tài)。 Viral DNA molecules are relatively small HIV = 9000 nt RNA Qβ = 4200 nt Bactaria DNA is 100 times > than viral E.coli 4639221 bp double-stranded Contour length = 1.7mm, 850倍細(xì)菌本身長(zhǎng)度。細(xì)菌中常常帶有質(zhì)粒DNA。Eucaryotic cells 果蠅帶有25倍于E.Coli 的DNA,人類帶有600倍于E.Coli 的DNA.Eucaryotic DNA 中基因密度明顯低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只帶有50個(gè)基因,而E.Coli中基因密度每毫米DNA帶有2400個(gè)基因！一個(gè)人細(xì)胞中所帶有的DNA約有2m/1.7mm細(xì)菌。成人帶有1X10^14個(gè)細(xì)胞，成人體內(nèi)全部 DNA的總長(zhǎng)度（Contour Length）＝ 2X10^11Km第三講 蛋白質(zhì)合成 一.基因與基因表達(dá)的一般概念 基因作為唯一能夠自主復(fù)制、永久存在的單位，其生理學(xué)功能以蛋白質(zhì)形式得到表達(dá)。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復(fù)制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成mRNA，翻譯生成蛋白質(zhì)的過程控制所有生命現(xiàn)象。 編碼鏈（coding strand）又稱sense strand，是指與mRNA序列相同的那條鏈。非編碼鏈（anticoding strand），又稱antisense strand，是指那條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA生物合成的DNA鏈。Genetic information is perpetuated by replication（復(fù)制）in which a double-stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies.基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之 外）的RNA單鏈的過程，是基因表達(dá)的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過程，是 基因表達(dá)的最終目的。 只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。所謂翻 譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開始，按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。 二.遺傳密碼——三聯(lián)子 mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼，也叫三聯(lián)子密碼。翻譯時(shí)從起始密碼子AUG開始，沿mRNA5’→3’的方向連續(xù)閱讀直到終止密碼子，生成一條具有特定序列的多肽鏈。 mRNA中只有4種核苷酸，而蛋白質(zhì)中有20種氨基酸，若以一種核苷酸代表一種氨基酸，只能代表4種(41=4)。若以兩種核苷酸作為一個(gè)密碼（二聯(lián) 子），能代表42=16種氨基酸。而假定以3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸，則可以有43=64種密碼，滿足了編碼20種氨基酸的需要。 50-60年代破譯遺傳密碼方面的三項(xiàng)重要成果:（1）Paul Zamecnik等人證實(shí)細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。他們把放射性標(biāo)記的氨基酸注射到大鼠體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后收獲其肝臟，進(jìn)行蔗糖梯度沉淀并分析各種細(xì)胞成份中的放射性蛋白質(zhì)。 如果注射后經(jīng)數(shù)小時(shí)（或數(shù)天）收獲肝臟，所有細(xì)胞成份中都帶有放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì);如果注射后幾分鐘內(nèi)即收獲肝臟，那么，放射性標(biāo)記只存在于含有核糖體顆粒的細(xì)胞質(zhì)成份中。 （2）Francis Crick等人第一次證實(shí)只有用三聯(lián)子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個(gè)字母組成遺傳信息（核酸）準(zhǔn)確無(wú)誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)1: 用吖啶類試劑（誘導(dǎo)核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點(diǎn)上的兩個(gè)基因，使之發(fā)生移碼突變（frame-shift），就生成完全不同的、沒有功能的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)2: 研究煙草壞死衛(wèi)星病毒發(fā)現(xiàn)，其外殼蛋白亞基由400個(gè)氨基酸組成，相應(yīng)的RNA片段長(zhǎng)1200個(gè)核苷酸，與密碼三聯(lián)子體系正好相吻合。實(shí)驗(yàn)3: 以均聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質(zhì)因子的細(xì)胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作為模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分時(shí)又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板時(shí)發(fā)現(xiàn)合成了多聚苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。實(shí)驗(yàn)4: 以特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2個(gè)氨基酸組成的多肽，5'?UGU GUG UGU GUG UGU GUG?3',不管讀碼從U開始還是從G開始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）兩種密碼子。實(shí)驗(yàn)5: 以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚（UUC）為模板，可能有3種起讀方式: 5’?UUC UUC UUC UUC UUC?3’或 5’?UCU UCU UCU UCU UCU?3’或 5'?CUU CUU CUU CUU CUU?3'分別產(chǎn)生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸為模板時(shí)也可能只合成2種多肽:5’?GUA GUA GUA GUA GUA?3’或5’?UAG UAG UAG UAG UAG?3’ 或5’?AGU AGU AGU AGU AGU?3’由第二種讀碼方式產(chǎn)生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產(chǎn)生GUA（Val）或AGU（Ser）。實(shí)驗(yàn)6: 以隨機(jī)多聚物指導(dǎo)多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機(jī)的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列時(shí) 可出現(xiàn)8種三聯(lián)子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨 基酸組成的多肽。 （3）氨基酸的“活化”與核糖體結(jié)合技術(shù)。 如果把氨基酸與ATP和肝臟細(xì)胞質(zhì)共培養(yǎng)，氨基酸就會(huì)被固定在某些熱穩(wěn)定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上?，F(xiàn)將氨基酸活化后的產(chǎn)物稱為氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反應(yīng)液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相 對(duì)分子質(zhì)量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結(jié)合的AA-tRNA則留在濾膜上，這樣可把已結(jié)合與未結(jié)合的AA-tRNA分開。當(dāng)體系中帶有多聚核苷酸模板時(shí)，從大腸桿菌中提取的核糖體經(jīng)常與特異性氨基酰-tRNA相結(jié)合。如果把核糖體與poly（U）和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時(shí)與poly（U）和Phe-tRNAPhe相結(jié)合。 4種核苷酸組成61個(gè)編碼氨基酸的密碼子和3個(gè)終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對(duì)，但能被終止因子或釋放因子識(shí)別，終止肽鏈的合成。由一種以 上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。 三.密碼子和反密碼子的相互作用 蛋白質(zhì)生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對(duì)與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據(jù)立體化學(xué)原理提出擺動(dòng)假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個(gè)以上同源密碼子的配對(duì)問題。Wobble hypothesis 1 任意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應(yīng)堿基形成Watson-Crick堿基配對(duì)。反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能識(shí)別一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能識(shí)別兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine（I）作為反密碼子第一位時(shí)，能識(shí)別三個(gè)密碼子。3 如果數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自的tRNA。 ④ 根據(jù)上述規(guī)則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個(gè)密碼子。 四.tRNA tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個(gè)三聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體 上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點(diǎn)和A位點(diǎn)結(jié)合，此時(shí)，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子:反密碼子的配對(duì)與mRNA相結(jié) 合，而其3’末端恰好將所轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，所有tRNA均專一于 相同的氨基酰-tRNA合成酶。 1、tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu) 受體臂（acceptor arm）主要由鏈兩端序列堿基配對(duì)形成的桿狀結(jié)構(gòu)和3’端末配對(duì)的3-4個(gè)堿基所組成，其3’端的最后3個(gè)堿基序列永遠(yuǎn)是CCA，最后一個(gè)堿基的3’或 2’自由羥基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根據(jù)3個(gè)核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。反密碼子臂是根據(jù)位于 套索中央的三聯(lián)反密碼子命名的。D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常見的tRNA分子有76個(gè)堿基，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95個(gè)核苷酸不等，tRNA分子長(zhǎng)度的不同主要是由其 中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是 在反密碼子3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對(duì)于維持反密碼子環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。2.tRNA的L形三級(jí)結(jié)構(gòu) 酵母和大腸桿菌tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)都呈L形折疊式。這種結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AA-tRNA合成酶的識(shí)別有關(guān)。受體臂和TφC臂的桿狀區(qū)域構(gòu)成了第一個(gè)雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了第二個(gè)雙螺旋。 tRNA的L形高級(jí)結(jié)構(gòu)反映了其生物學(xué)功能，因?yàn)樗纤\(yùn)載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以兩個(gè)不同的功能基團(tuán)最大限度分離。3.tRNA的功能 轉(zhuǎn)錄過程是信息從一種核酸分子（DNA）轉(zhuǎn)移至另一種結(jié)構(gòu)上極為相似的核酸分子（RNA）的過程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對(duì)。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機(jī)制。 4.tRNA的種類 （1）起始tRNA和延伸tRNA 能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA-tRNA合成酶識(shí)別。（3）校正tRNA 校正tRNA分為無(wú)義突變及錯(cuò)義突變校正。在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱為無(wú)義突變。 五.AA-tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反應(yīng)式如下: 它實(shí)際上包括兩步反應(yīng): 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨?；D(zhuǎn)移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’-羥基結(jié)合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP 蛋白質(zhì)合成的真實(shí)性主要決定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸與對(duì)應(yīng)的tRNA相結(jié)合。AA-tRNA合成酶既要能識(shí)別tRNA，又要能識(shí)別氨基酸，它對(duì)兩者都具有高度的專一性。不同的 tRNA有不同堿基組成和空間結(jié)構(gòu)，容易被tRNA合成酶所識(shí)別，困難的是這些酶如何識(shí)別結(jié)構(gòu)上非常相似的氨基酸。有兩道關(guān)口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖體像一個(gè)能沿mRNA模板移動(dòng)的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。它是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)，在未成熟的蟾蜍卵細(xì)胞內(nèi)則高達(dá)1012。核糖體 和它的輔助因子為蛋白質(zhì)合成提供了必要條件。 1.核糖體的組成 原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質(zhì)組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質(zhì)占2/5。核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的rRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1??S21表示，大亞基由33種蛋白質(zhì)組成，分別用L1??L33表示。真核生物細(xì)胞核糖體大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)。 2、rRNA 3.核糖體的功能 核糖體包括至少5個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）、結(jié)合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心），此外還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合 位點(diǎn)。小亞基上擁有mRNA結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)序列特異的識(shí)別過程，如起始位點(diǎn)的識(shí)別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負(fù)責(zé)氨基酸及tRNA攜帶的功 能，如肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合等。A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。 核糖體可解離為亞基或結(jié)合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成70S/80S顆粒，繼續(xù)翻譯進(jìn)程。體外反應(yīng)體系中，核糖體 的解離或結(jié)合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時(shí)，70S解離為亞基，濃度達(dá)10-2mol/L時(shí)則形成穩(wěn)定 的70S顆粒。細(xì)胞中大多數(shù)核糖體處于非活性的穩(wěn)定狀態(tài)，單獨(dú)存在，只有少數(shù)與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的5'末端向3'末端閱讀密碼 子，至終止子時(shí)合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長(zhǎng)短而定，一般40個(gè)核苷酸有一個(gè)核糖體。 七.信使核糖核酸 mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過三聯(lián)子密碼翻譯生成蛋白質(zhì)，其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)是不同的。 八、蛋白質(zhì)的生物合成 核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起 始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過程。蛋白質(zhì)合成消耗了細(xì)胞中90%左右用于生物合成反應(yīng)的能量。細(xì)菌細(xì)胞中的2萬(wàn)個(gè)核糖體，10萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)因子和20萬(wàn)個(gè)tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個(gè)100個(gè)氨基酸的多肽只需5分鐘。 1.蛋白質(zhì)生物合成的主要步驟: 翻譯的起始——核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰-tRNA生成起始復(fù)合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，導(dǎo)致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。主要分為五步 1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步 Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.2 Peptide bond formation.3 Translocation.2.與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的因子 起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF1-3。RF-1 識(shí)別 UAA和UAG;RF-2 識(shí)別 UAA和UGA;RF-3 僅能促進(jìn)RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時(shí)需要GTP。真核生物中只有一個(gè)RF，能識(shí)別3個(gè)終止子。 3、蛋白質(zhì)合成的起始 蛋白質(zhì)合成的起始復(fù)合物: 30S 核糖體小亞基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖體大亞基 Mg2+ 合成的起始可分為三步: 1、30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF-3相結(jié)合，誘發(fā)模板mRNA與小亞基結(jié)合。 2、由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所組成的復(fù)合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結(jié)合。反密碼子與密碼子配對(duì)。 3、上述六組分復(fù)合物再與50S大亞基結(jié)合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個(gè)起始因子。 表27-9 真核細(xì)胞中參與翻譯起始的蛋白質(zhì)因子及其功能 真核因子 功能 eIF2 促進(jìn)Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結(jié)合。eIF2B eIF3 是最早與核糖體40S小亞基結(jié)合的促進(jìn)因子，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的正常進(jìn)行。eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級(jí)結(jié)構(gòu)并使之與40S小亞基結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF4B 與mRNA模板相結(jié)合，協(xié)助核糖體掃描模板序列，定位AUG。eIF4E 與mRNA 5'的帽子結(jié)構(gòu)相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF4G 與eIF4E和poly（A）結(jié)合蛋白（PAB）相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。eIF5 促使多個(gè)蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結(jié)合形成80核糖體，形成翻譯起始復(fù)合物。 eIF6 促進(jìn)沒有蛋白質(zhì)合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個(gè)亞基。 4、肽鏈的延伸 肽鏈延伸的基本要求是 : 有完整的起始復(fù)合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。 肽鏈延伸也可被分為三步: 第一步，與新進(jìn)來的氨基酰-tRNA相結(jié)合。氨基酰-tRNA首先必須與GTP-EF-Tu復(fù)合物相結(jié)合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu復(fù)合物并與70S中的A位點(diǎn)相結(jié)合。此時(shí)，GTP水解并釋放GDP-EF-Tu復(fù)合物。 第二步，肽鍵形成。肽鍵形成之初，兩個(gè)氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結(jié)合，仍然分別位于A位點(diǎn)和P位點(diǎn)上。A位點(diǎn)上的氨基酸（第二個(gè)氨基酸）中的α-氨基作為親核基團(tuán)取 代了P位點(diǎn)上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團(tuán)形成肽鍵。本反應(yīng)可能由peptidyl transferase 催化。 第三步，移位（translocation）。核糖體向mRNA的3’方向移動(dòng)一個(gè)密碼子，使得帶有第二個(gè)氨基酸（現(xiàn)已成為二肽）的tRNA從A位進(jìn)入P位，并使第一個(gè)tRNA從P位進(jìn)入E位。此時(shí)模 板上的第三個(gè)密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。 5、肽鏈的終止 當(dāng)終止密碼子進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)時(shí)，在釋放因子RF1-3的作用下:（1）水解末端肽基tRNA；（2）釋放新生肽和tRNA； （3）使70S核糖體解離成30S和50S兩個(gè)亞基。 6、蛋白質(zhì)合成的抑制劑 抗菌素對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結(jié)合（氯霉素），或阻止AA-tRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素類），或干擾AA-tRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯(cuò)讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制蛋白質(zhì)合成。鏈霉素是一種堿性三糖，干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，并導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會(huì)摻入。對(duì)鏈霉素敏感位點(diǎn)在30S亞基上。 嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進(jìn)入。它所帶的氨基與AA-tRNA上的氨基一樣，能與生長(zhǎng)中肽鏈上的羧基生成肽鍵，這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。 青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真 核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，前3種抗生素被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)，后兩種則很少在醫(yī)學(xué)上使用 第四講 DNA、RNA和蛋白質(zhì)代謝 DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控 制了細(xì)胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能夠得到表達(dá)。DNA和RNA雖然很相似，只 有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜；RNA既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。 蛋白質(zhì)是生物信息通路上的終產(chǎn)物，一個(gè)活細(xì)胞在任何發(fā)育階段都需要數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。因此，活細(xì)胞內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著各種蛋白質(zhì)的合成、修飾、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解反應(yīng)。 一、核苷酸的合成與代謝 核苷酸是DNA和RNA的前體是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)能流通領(lǐng)域中的載體（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP還是第二信使。 1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate） 這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻(xiàn)一個(gè)氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。 其次，把甘氨酸中的三個(gè)基團(tuán)加到PRA上。第三，由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第四，谷氨酰胺提供另一個(gè)N。第五，脫水環(huán)化形成咪唑環(huán)。第六，羧基化 第七，通過分子重排將羧基從咪唑第4碳的環(huán)外氨基上轉(zhuǎn)移到第5位碳原子上。第八-九，由天門冬酰胺把另一個(gè)氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氫葉酸提供一個(gè)甲基。第十一，脫水環(huán)化，形成嘌呤IMP。 參與合成AMP的是1腺苷琥珀酸合成酶和2腺苷琥珀酸裂解酶。參與合成GMP的是3IMP脫氫酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶。 2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調(diào)節(jié) 3.嘧啶核苷酸是由天門冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的 嘧啶從頭合成途徑不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶環(huán)首先被合成，然后才與核糖-5-磷酸相連。這個(gè)反應(yīng)需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4.核苷單磷酸轉(zhuǎn)化為核苷三磷酸 反應(yīng)生成的ADP可通過糖酵解酶或氧化磷酸化途徑被進(jìn)一步磷酸化。ATP能夠把磷酸基團(tuán)加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。 核苷二磷酸可通過一個(gè)公用的核苷二磷酸激酶被進(jìn)一步磷酸化生成核苷三磷酸。 5.核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。所有dNTP都直接來自于 NTP（其實(shí)是NDP）。這個(gè)反應(yīng)很特殊，因?yàn)楹颂巧系倪€原反應(yīng)發(fā)生于一個(gè)沒有活化的碳原子上。催化該反應(yīng)的酶是核糖核苷酸還原酶。大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學(xué)活性和底物特異性同時(shí)受效應(yīng)子（effector molecules）的影響。每個(gè)R1亞基上都有兩個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，當(dāng)影響整體酶活性的那個(gè)位點(diǎn)與ATP相結(jié)合時(shí)，酶活性增加；而當(dāng)它與dATP結(jié)合時(shí)，酶活性消失。第二個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)控制了底物特異性。當(dāng)dATP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，UDP和CDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。當(dāng)dTTP與該位點(diǎn)相結(jié)合時(shí)，GDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。核糖核苷酸還原反應(yīng)的主要過程 1.還原酶R2亞基處于氧化態(tài)-X˙，向核糖3'位碳原子上的H發(fā)起攻擊，生成3'位自由基。2.R1亞基上的-SH基團(tuán)為2'-OH提供一個(gè)H原子，使之生成-OH2基團(tuán)。3.脫水后，3'位自由基幫助維持2'位O+基團(tuán)。 4.R1亞基上的另一個(gè)-SH基團(tuán)為2'-CH+提供一個(gè)H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亞基上的X-H發(fā)起攻擊。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）來自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP；反應(yīng)中的甲基來自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。 7、嘌呤和嘧啶降解后分別生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解 第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團(tuán)，由Adenosine-monophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。 二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine； 三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine； 四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine； 五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代謝突變會(huì)引起重要疾病。 如人體內(nèi)缺失adenosine deaminase，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的免疫缺失性疾病，因?yàn)榇藭r(shí)T-淋巴和B-淋巴細(xì)胞不能正常發(fā)育。AD缺失后，細(xì)胞內(nèi)dATP的含量將高達(dá)正常細(xì)胞中的 100倍，而過量的dATP則抑制了其余dNTP在T-淋巴細(xì)胞中的合成。許多化療（chemotherapy）藥劑都針對(duì)核苷酸合成途徑。如 Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。 胸苷合成中的主要抑制劑有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基葉酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是 thymidylate synthase 抑制劑，但它在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為FdUMP以后，就能直接與TS相結(jié)合并使之失活。氨甲基葉酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制劑，氨甲基葉酸與該酶的親和力比底物dihydrofolate高100倍。 二、氨基酸代謝 按所占的質(zhì)量比例計(jì)算，N在生物體內(nèi)的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有機(jī)氮，被結(jié)合于氨基酸或核苷酸分子中。 地球上的動(dòng)植物共含氮約1.5×1010t，而每年通過硝化細(xì)菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥廠每年生產(chǎn)的化肥僅含氮約108t，所以，如果沒有生物固氮，生命很快就不復(fù)存在了。 1.銨通過谷氨酸→谷氨酰胺被結(jié)合到有機(jī)物質(zhì)中。主要有兩步反應(yīng): ⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 總結(jié): Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+ 因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調(diào)控位點(diǎn)。 在大腸桿菌中，GS由12個(gè)相同的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過構(gòu)象變化，也能通過共價(jià)修飾的方式得到調(diào)節(jié)。Alanine，Glycine 和其它至少6種gln代謝產(chǎn)物都是GS活性的變構(gòu)抑制劑，每個(gè)抑制劑都只有部分抑制作用。除變構(gòu)抑制之外，GS活性還受共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)?97位酪氨酸 被腺苷化后（加上AMP），該酶更容易受變構(gòu)抑制劑的反饋調(diào)節(jié)。 2.氨基酸的生物合成 高等動(dòng)物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)表22-1 氨基酸合成的六條主要途徑 3.氨基酸脫羧基化后生成有機(jī)胺。許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)都是胺或其次生代謝產(chǎn)物。Tyrosine降解產(chǎn)物有dopamine（多巴胺），epinephrine（腎上腺素），norepinephrine，統(tǒng)稱為Catecholamines（兒茶酚胺）。 4.精氨酸降解產(chǎn)生NO˙(Nitric Oxide)。 本世紀(jì)80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)NO是人體內(nèi)重要的信號(hào)分子，它參與神經(jīng)傳遞、凝血和血壓調(diào)控等一系列生理反應(yīng)。雖然它是氣體，極易擴(kuò)散，但由于它十分活躍，其擴(kuò)散半徑一般只有1mm。 三、氨基酸及功能蛋白質(zhì)合成后的修飾 1.蛋白質(zhì)剛剛被合成時(shí)，都以fMet（原核）或Met（真核）開始，多肽合成后，N端的formyl group、Met殘基，有時(shí)還包括N揣多個(gè)殘基或C端的殘基都會(huì)被切除。50%的真核蛋白中，N-端殘基的氨基酸會(huì)被N-乙基化。 2.切除信號(hào)肽。許多蛋白質(zhì)都帶有15-30個(gè)殘基的signal peptides，負(fù)責(zé)指導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的精確定位。3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化 5.氨基酸的異戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白質(zhì)還要與輔基(prosthetic groups)相結(jié)合； Cytochrome C只有與血紅素（heme）相結(jié)合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常與Biotin分子相結(jié)合。有些蛋白質(zhì)必須經(jīng)蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質(zhì)只有在形成二硫鍵之后才有功能。 四、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和降解 1、絕大部分被運(yùn)入ER內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)Signal peptide。該序列常常位于蛋白質(zhì)的氨基末端，長(zhǎng)度一般在13-36個(gè)殘基之間，有三個(gè)特點(diǎn):（1）一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸；（2）常常在靠近該序列N-端疏水氨基酸區(qū)上游帶有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（Ala或Gly）。 研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽把Ribosome牽引到ER上。蛋白質(zhì)合成之初，一旦信號(hào)肽序列的N端暴露在核糖體外，該序列（包括核糖體）就迅速與SRP（signal recognition particle）相結(jié)合，誘發(fā)SRP與GTP相結(jié)合，停止新生肽的進(jìn)一步延伸（此時(shí)新生肽一般長(zhǎng)約70個(gè)殘基左右）。 受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牽引，這個(gè)復(fù)合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠攏，并通過peptide transport complex進(jìn)入ER內(nèi)腔。 5.Rough ER上的蛋白質(zhì)常常通過運(yùn)轉(zhuǎn)載體將經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)送入高爾基體，再分別送到各個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)。 6.蛋白質(zhì)中的核定位序列一般不被切除。 蛋白質(zhì)的核定位是通過多個(gè)蛋白的共同作用來實(shí)現(xiàn)的。Importin(α,β亞基)的作用有點(diǎn)像SRP受體。NLS蛋白-Importin復(fù)合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通過核孔。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在類似的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)。 7、蛋白質(zhì)降解是一個(gè)有序的過程。 在大腸桿菌中，許多蛋白質(zhì)的降解是通過一個(gè)依賴于ATP的蛋白酶（稱為L(zhǎng)on）來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中存在有錯(cuò)誤或半衰期很短的蛋白質(zhì)時(shí)，該蛋白酶就被激活。每切除一個(gè)肽鍵要消耗兩分子ATP。 在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解需要Ubiquitin，一個(gè)有76個(gè)氨基酸殘基組成極為保守的蛋白參與。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個(gè)依賴于ATP的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（Proteasome，Mr.1×106）。 成熟多肽N-端第一個(gè)殘基對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有重要影響。 五、DNA代謝 無(wú)論是只含有一對(duì)染色體的原核細(xì)胞還是帶有多對(duì)染色體的真核細(xì)胞，只有整個(gè)基因組得到了完整準(zhǔn)確的復(fù)制，細(xì)胞分裂才能順利發(fā)生。所以說，DNA復(fù)制的起始，標(biāo)志了細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)新的周期。㈠、DNA復(fù)制 根據(jù)反應(yīng)階段和所需的不同酶類，DNA的復(fù)制可被分為三個(gè)階段，即復(fù)制起始、延伸和終止。每個(gè)DNA復(fù)制的獨(dú)立單元被稱為復(fù)制子（replicon），主 要包括復(fù)制起始位點(diǎn)（Origine of replication）和終止位點(diǎn)（terminus）。原核生物的整個(gè)染色體上一般只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 大腸桿菌DNA的復(fù)制需要有20種左右的酶和蛋白質(zhì)因子參與，整個(gè)DNA復(fù)制機(jī)器被稱之為DNA replicase system或replisome。 Helicase，任何DNA在被復(fù)制前都必須解開雙鏈，這個(gè)過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。 Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產(chǎn)生的扭曲力。DNA結(jié)合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Primases，為DNA復(fù)制提供RNA引物。 DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。 DNA Ligases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯鍵。1.DNA復(fù)制的起始 大腸桿菌中的復(fù)制起始位點(diǎn)是Ori C，全長(zhǎng)245Bp，該序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)中都是保守的。 DNA復(fù)制起始中的主要步驟 a.大約20個(gè)左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個(gè)9堿基重復(fù)區(qū)相結(jié)合； b.識(shí)別并使3個(gè)13堿基串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開環(huán)結(jié)構(gòu)； c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個(gè)DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時(shí)起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時(shí)，DnaB的解鏈效率非常高。整個(gè)DNA復(fù)制過程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控?！癘nce in each cell cycle?！?DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個(gè)GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說來，256bp才應(yīng)有一個(gè)GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈 立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時(shí)，oriC與細(xì)胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能 有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過程調(diào)控，因?yàn)镈naA只有與ATP相結(jié)合時(shí)才能與oriC區(qū)DNA相結(jié) 合。2.DNA子鏈的延伸 主要包括兩個(gè)不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。 前導(dǎo)鏈的合成:由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點(diǎn)附近合成一個(gè)10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。 滯后鏈的合成:產(chǎn)生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補(bǔ)上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個(gè)片段相連。3.DNA鏈的終止 當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個(gè)20bp序列）時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個(gè)陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來。Ter的功能主 要是由Ter-Tus復(fù)合物（ter utilization substance）來完成的。4.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更復(fù)雜 真核生物的origin of replication被稱為ARS-autonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長(zhǎng)約150dp，有多個(gè)保守重復(fù)區(qū)，共有約500個(gè)replicators分布于酵母的17條染色體中。 ㈡、DNA的損傷修復(fù) 1.錯(cuò)配修復(fù)（mismatch Repair） 錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá)102-103，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。 2.堿基切除修復(fù)（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特異性識(shí)別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic）。細(xì)胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excision repair）當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無(wú)法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)。 4.DNA的直接修復(fù)（Direct repair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座 DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)座”這一命名并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來位置上，在新位點(diǎn) 上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。1.轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征 a.簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個(gè)IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成 該基因突變。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。 b.復(fù)合式轉(zhuǎn)座子（composite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基 因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨(dú)移動(dòng)，因?yàn)樗鼈兊墓δ鼙恍揎椓?，只能作為?fù)合體移動(dòng)。 2、轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制 轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶 序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長(zhǎng)度不同，但對(duì)于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長(zhǎng)度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對(duì)的靶序列，而Tn3兩 端總有5bp的靶序列。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。3.轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng) 轉(zhuǎn)座引起插入突變;2 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因;3 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變;④ 轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.六、RNA代謝 除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA?；蚪MDNA通過一個(gè)被稱為轉(zhuǎn)錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換到與模板DNA鏈相互補(bǔ)的RNA單鏈上。 mRNA，編碼了一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔ⅲ籸RNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。1.依賴于DNA的RNA合成 從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來說，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個(gè)主要不同點(diǎn): A.轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物； B.轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板； C.在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。2.RNA合成的終止 一旦RNA聚合酶啟動(dòng)了基因轉(zhuǎn)錄，它就會(huì)沿著模板5'→3'方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到遇到終止信號(hào)時(shí)才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。 研究RNA鏈終止時(shí)遇到最常見的問題是3'端核苷酸的定位，因?yàn)榛罴?xì)胞內(nèi)部根據(jù)終止信號(hào)正確終止的RNA與一個(gè)經(jīng)過剪接的RNA在3'端沒有兩樣，都是-OH基團(tuán)。模板DNA上都有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號(hào)--終止子，每個(gè)基因或操縱子都有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)終止子。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合 酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。a.依賴于ρ因子的終止 ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。有人認(rèn)為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸 酶兩種功能。b、不依賴于ρ 因子的終止 若終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。3.RNA聚合酶II及轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子上的裝配 TFⅡH還參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄過程中碰到受損傷的核苷酸時(shí)，TFⅡH能及時(shí)啟動(dòng)核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 4.RNA的加工成熟 所以，RNA加工成熟主要包括:5’加帽子結(jié)構(gòu)；3’加多聚A；切除內(nèi)含子。在Group I內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3'-OH 作為親核基團(tuán)向Intron 5'的磷酸二酯鍵發(fā)起進(jìn)攻。 Group II內(nèi)含子切除體系 核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。第五講 分子生物學(xué)研究法 一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題； 3.50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。年份 事 件 1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。 1944 O.T.Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 A.D.Hershey和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。 1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。 1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 1959-1960 S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。 1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由“質(zhì)?！盌NA所決定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體φ174基因組測(cè)定。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。 1980 美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。 1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。 1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。 1988 J.D.Watson出任“人類基因組計(jì)劃”首席科學(xué)家。 1989 DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧--“Oncomouse”。 1992 歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定(315kb)1994 第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。 1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測(cè)定。 1997 英國(guó)愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。 基因工程中常見的名詞: 遺傳工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重組DNA技術(shù)--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning?；蚬こ痰闹饕獌?nèi)容或步驟: 1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。 2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。 3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。 4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。 5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 二、基因操作的主要技術(shù)原理 1.核酸的凝膠電泳(Agarose & Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。 在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術(shù) FGE-Pulse-field gel electrophoresis 2.核酸的分子雜交技術(shù) 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印” 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟: 將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)； 將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3.細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受 態(tài)（Competent Cells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。對(duì)絕大多數(shù)hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。4.DNA序列分析 a.Sanger的雙脫氧鏈終止法 Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下: 1DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；2該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無(wú)5'→3'外切酶活性。b.Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué))該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。 該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng): 堿基的特異性修飾； 被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移； 失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。 專門用來對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。 c.DNA序列分析自動(dòng)化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。 d.DNA雜交測(cè)序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段較短的DNA探針能與較長(zhǎng)的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本 原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種 探針會(huì)與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。 當(dāng)靶DNA與標(biāo)記探針形成G-T或G-A末端堿基錯(cuò)配的雙鏈體時(shí)，檢測(cè)有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較易與完全的雙鏈 體分子相區(qū)分。但是，探針短，雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降，信/噪比下降，影響結(jié)果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測(cè)定500bp的靶 DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的應(yīng)用: 1 可有效檢測(cè)靶DNA中的單堿基突變； 2 可用于不同DNA片段之間的序列比較； 可用于檢測(cè)不同生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況； ④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。 5.基因的定點(diǎn)誘變（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 a.盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。 b.寡核苷酸引物誘變 應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。 C.PCRG與PCR誘變 6.利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(yàn)(DNA mobility shift assay--EMSA)。 b.DNase I 印跡試驗(yàn)（DNase I foot printing） 主要步驟: 1 用32P標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端； 2 加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育； 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。 這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂?、艹恋鞤NA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）； ⑤進(jìn)行DNA凝膠分析。 如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。 c.甲基化干擾試驗(yàn)(Methylation interference assay) 用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個(gè)G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩試驗(yàn)。分離各種 DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個(gè)G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，那么，六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA中觀察到。 d.體內(nèi)足跡試驗(yàn) 用適量DMS處理完整的游離細(xì)胞，使染色質(zhì)中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對(duì)照的裸露DNA經(jīng)甲基化處理后形成的梯度相對(duì)照，就能發(fā)現(xiàn)DNA鏈上的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)。 三、分子克隆技術(shù) 1、高質(zhì)量mRNA的制備 應(yīng)用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated Oligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2.反轉(zhuǎn)錄成cDNA 可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA； 應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）； 應(yīng)選用甲基化dCTP； 應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。 Super Script Choice cDNA合成系統(tǒng)中所用的poly（dT）引物 因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應(yīng)選用mcrA-mcrB-菌株。 3.分子克隆的主要方法 （1）構(gòu)建cDNA、核DNA文庫(kù)，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術(shù)；（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術(shù)； （4）差別分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system； （6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移（genomic DNA Walking）。 習(xí)慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。分子生物學(xué)上，把將外源DNA插入具有自主復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以自主復(fù)制和永久保存的過 程叫做分子克隆。 文庫(kù)篩選與基因豐度有關(guān)。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細(xì)胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般 在細(xì)胞中只有10-20個(gè)拷貝，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達(dá)到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個(gè)克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產(chǎn)生10萬(wàn)-60萬(wàn)個(gè)克隆子。 A.差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù) B.cRNA差式顯示法 除了極少數(shù)特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly(A)尾巴。 P.Liang等人設(shè)計(jì)合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有 12種不同的排列組合方式。 DDRT-PCR的主要步驟: Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA； Ⅱ.用5'隨機(jī)引物和某個(gè)3'端錨定引物對(duì)擴(kuò)增第一鏈(摻入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA變性測(cè)序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測(cè)差別條帶； Ⅳ.回收特異性差別條帶； Ⅴ.用同一引物對(duì)擴(kuò)增已回收的DNA條帶； Ⅵ.用Northern，Southern及測(cè)序法分析所得的條帶； Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長(zhǎng)cDNA或核基因。 C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis) RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)?試驗(yàn)對(duì)象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃復(fù)性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。 D.酵母雙雜交體系 Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（target protein）相互作用的基因。 基本原理: 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結(jié)合域（BD），其C端768-881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，而此時(shí)，AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。 若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無(wú)法被激活,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的AD或BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。 主要實(shí)驗(yàn)過程: a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.構(gòu)建帶有GAL1 UAS-啟動(dòng)子-lac Z（His3）的轉(zhuǎn)化載體;c.把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫(kù)。 d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽(yáng)性菌落。 E.基因的圖位克隆法 Map-based cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體 的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。 二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè) 標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。 三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。 通過對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計(jì)算的，1cm（厘米）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。 四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重復(fù)序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡(jiǎn)單的例子是用機(jī)械手把極微量（nanoliters）的DNA點(diǎn)到玻 片或其它載體上，照射UV light使之永久固定，用不同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部全部已知基因分別點(diǎn)到 DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立 正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。第六講 原核基因表達(dá)調(diào)控 原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測(cè)的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無(wú)保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，才 能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個(gè)每30min增殖一倍的109細(xì)菌群體中，若有一個(gè)細(xì)菌變成了29.5min增殖一 倍，大約經(jīng)過80天的連續(xù)生長(zhǎng)后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長(zhǎng)速度。 一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中約有2500-3000個(gè)基因。估計(jì)正常情況下，可帶有107個(gè)蛋白質(zhì)，平均每個(gè)基因產(chǎn)生3000多個(gè)蛋白質(zhì)分子。但大腸桿菌中一般帶 有15,000-30,000個(gè)核糖體，有50余種核糖體結(jié)合蛋白，數(shù)量也很驚人。此外，負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導(dǎo)酶，其 含量可少至每細(xì)胞僅1-5個(gè)分子。 一個(gè)體系在需要時(shí)被打開，不需要時(shí)被關(guān)閉。這種“開-關(guān)”（on-off）活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。當(dāng)我們說 一個(gè)系統(tǒng)處于“off”狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成1或2個(gè)mRNA分子。所謂“關(guān)”實(shí)際的意思是基因表達(dá)量特別低，很 難甚至無(wú)法檢測(cè)。 科學(xué)家把這個(gè)從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)(gene expression)，對(duì)這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation或gene control)。要了解動(dòng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必須弄清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我 們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面: 1 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)； 3 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA).原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 一、乳糖操縱子的調(diào)控模式 大腸桿菌乳糖操縱子(lactose operon)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因:Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先與啟動(dòng)區(qū)(promoter,P)結(jié)合，通過操縱 區(qū)(operator,O)向右轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄從O區(qū)的中間開始，按Z→Y→A方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mRNA上都帶有這3個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是啟動(dòng)區(qū) 和操縱區(qū)進(jìn)行的。 Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡 萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì) 膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 1.酶的誘導(dǎo)-lac體系受調(diào)控的證據(jù) 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個(gè)大腸桿功細(xì)胞內(nèi)大約只有1-2個(gè)酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。 科學(xué)家把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S、無(wú) 放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無(wú)35S標(biāo)記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來 的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。 已經(jīng)分離在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生lacmRNA的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類:I型和O型。 I型:野生型為I+，突變型為I-O型:野生型為O+，突變型為Oc。 I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以I基因被稱為調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。研究發(fā)現(xiàn)，I基因是一個(gè)產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。I-突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為lac永久表達(dá)型。I-/I+局 部二倍體由于帶有一個(gè)正常阻遏物，使細(xì)胞中的lac仍然被抑制。 遺傳學(xué)圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個(gè)基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表 DNA鏈上的一個(gè)位點(diǎn)或一個(gè)非編碼區(qū)域，而不是一個(gè)基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久 型合成，O區(qū)域稱為操縱基因。 2.操縱子模型 Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，因此選為突破口，終于通過大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了該操縱子的控制模型。Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。這個(gè)mRNA分子的啟動(dòng)子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動(dòng)子區(qū)（P），不能單獨(dú)起動(dòng)合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。④當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。 ⑤誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動(dòng)子能夠順利起始mRNA的合成。 3.Lac操縱子的本底水平表達(dá) 因?yàn)檎T導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而運(yùn)轉(zhuǎn)誘導(dǎo)物需要透過酶。在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量（1-5個(gè)mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。 4.葡萄糖對(duì)lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應(yīng) 研究表明，葡萄糖對(duì)lac操縱子表達(dá)的抑制作用是間接的，因?yàn)榇嬖谝环N大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導(dǎo)合成lac mRNA。 5.cAMP與代謝物激活蛋白 當(dāng)葡萄糖和乳糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，lac啟動(dòng)子表達(dá)受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當(dāng)葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導(dǎo)，一度停止生長(zhǎng)的細(xì)胞又恢復(fù)分裂。如果將細(xì)菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)菌 中的cAMP濃度就會(huì)很低；如果將細(xì)菌置于甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解的碳源培養(yǎng)基中，細(xì)菌中cAMP的濃度也會(huì)很高。 研究證實(shí)，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是該代謝物降低了細(xì)胞中cAMP的含量.事實(shí)上，cAMP-CAP復(fù)合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。 cAMP-CAP不但能與DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個(gè)“環(huán)”的亞基存在，lacI+基因產(chǎn)物（阻遏物）無(wú)法與O區(qū)相結(jié)合lac operon得到表達(dá)。 6.lac操縱子DNA的調(diào)控區(qū)域--P.O.區(qū) lac P（啟動(dòng)子區(qū)）從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)止，共長(zhǎng)82bp（-82～+1）O區(qū)就是阻遏物結(jié)合區(qū)，位于P區(qū)后半部分和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（-7～+ 28），該區(qū)序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱中心點(diǎn)在+11位。P區(qū)的CAMP-CAP結(jié)合區(qū)（-67～-52）也有對(duì)稱性，其對(duì)稱位點(diǎn)在-60～-59之間。 在一個(gè)完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1:0.5:0.2，這個(gè)比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。 1lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。這種現(xiàn)象發(fā)生的頻率取決于每一個(gè)后續(xù)的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。2在lac mRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因? 實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化 一、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。 質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。 純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡(jiǎn)單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。 二、實(shí)驗(yàn)試劑 1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。 2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。 3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p> 4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p> 5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6、乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p> 8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml 9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。 10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。 三、實(shí)驗(yàn)操作 1、挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。 2、取1.0ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。 3、將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。 4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖海孰x心管中菌液逐漸變清）。 5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。 6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。 7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。 8、加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。 9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 四、質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè) 觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA。 取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測(cè)，攝片。 五、注意事項(xiàng) 本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復(fù)性好，一般無(wú)麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。 六、習(xí)題： 1、什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒有什么主要用途？ 2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用的質(zhì)粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個(gè)基本要素？ 3、制備的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？ 實(shí)驗(yàn) 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p> （1）學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的基本原理； （2）掌握使用水平式電泳儀的方法； 二、實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定： （1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。 （2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。 （3）電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 （4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復(fù)合物，在波長(zhǎng)為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對(duì)照，就可估算出待測(cè)樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如Sybergreen。 常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經(jīng)甲醛進(jìn)行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因?yàn)樽冃院蟮腞NA是單鏈，其泳動(dòng)速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進(jìn)行RNA分子大小的測(cè)定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標(biāo)記的探針發(fā)生高效雜交。 三、試劑與器材 （一）材料 電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等 （二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。 2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。 3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。 4、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 四、操作方法 常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳： 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表： 瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb） 0.3 60-5 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1 1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液；加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。 2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時(shí)，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面； 3、加樣：點(diǎn)樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點(diǎn)樣量）。 4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板中央時(shí)，停止電泳。 5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。 五、注意事項(xiàng) 1、EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡(jiǎn)單處理方法為：加入大量的水進(jìn)行稀釋（達(dá)到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。 2、由于EB會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準(zhǔn)確地測(cè)定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題 1、附上電泳結(jié)果的圖片并進(jìn)行正確的標(biāo)注（如下圖） M：1Kb DNA ladder；1：質(zhì)粒DNA 2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？ 3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點(diǎn)樣孔，你認(rèn)為有哪幾方面的原因？ 4、為什么分子生物學(xué)實(shí)施時(shí)要擔(dān)心EB？ 5、瓊脂糖凝膠電泳時(shí)膠中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？ 電泳流程圖： 實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增eGFP基因 一、PCR技術(shù)的基本原理 PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： ①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。 1、模板：?jiǎn)巍㈦p鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級(jí)的克隆DNA，ug 級(jí)的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。 2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC 含量類似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。 3、防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。 4、引物的長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，較長(zhǎng)引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。 5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退 二、實(shí)驗(yàn)試劑 （一）儀器與器皿 PRC 擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀 （二）試劑與材料 1、瓊脂糖凝膠電泳試劑 1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA 2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖 3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水 4）瓊脂糖 2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應(yīng)緩沖液： 125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25% 4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L) 5、DNA 模板 6、引物 1（10μmol/L） 7、引物 2（10μmol/L） 8、無(wú)菌水 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購(gòu)入的試劑批次不同，加樣時(shí)有所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。 1）ddH2O 37μl 2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2) 3）dNTP ２μl 4）引物1(上游)２μl 5）引物2（下游）２μl 6）模板 1μl（pEGFP質(zhì)粒） 7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl 2、在PCR 擴(kuò)增儀上按以下反應(yīng)條件編入程序：（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA片段不同，各類PCR 擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過程視擴(kuò)增的DNA 片段的要求及儀器而定參數(shù)。） 1)預(yù)變性 94℃ 3 分種 2)循環(huán)條件（30 次） 變性 94℃ 30 秒 復(fù)性 55℃ 30 秒 延伸 72℃ 1分 3)延長(zhǎng)延伸 72℃ 7 分鐘 編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開動(dòng)機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開始。 3、PCR 擴(kuò)增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結(jié)果。 4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的DNA片段 四、習(xí)題 1、PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？ 2、為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個(gè)不同的溫度變化？ 3、用PCR擴(kuò)增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項(xiàng)？ 實(shí)驗(yàn) 從動(dòng)物組織（豬肝）中提取DNA 一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的 (1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細(xì)胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。 三、實(shí)驗(yàn)材料 新鮮豬肝 TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎； 2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻； 3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次； 4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 ml離心管中； 5、加入2倍體積（1000 μl）的無(wú)水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇； 6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進(jìn)行電泳分析。 五、注意事項(xiàng) 1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。 2、抽提每一步用力要柔和，防止機(jī)械剪切力對(duì)DNA的損傷。 3、取上層清液時(shí)，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。 4、乙醇漂洗去乙醇時(shí)，不要蕩起DNA。 5、離心后，不要晃動(dòng)離心管，拿管要穩(wěn)。 6、在乙醇沉淀后，經(jīng)離心要觀察留在EP管中的小白點(diǎn)，其主要成分就是DNA，在以后的實(shí)驗(yàn)中都要細(xì)心觀察，防止因?qū)⑿“c(diǎn)丟失。 六、習(xí)題 1、為了獲得高質(zhì)量的肝臟DNA，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意什么。 2、結(jié)合本人操作體會(huì)，總結(jié)在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。 3、核酸提取中，去除蛋白質(zhì)的方法有哪些？ 實(shí)驗(yàn) 限制性內(nèi)切酶切割DNA 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p> 1． 通過對(duì)DNA的酶切，學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組DNA分子； 2． 根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識(shí)別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對(duì)稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識(shí)別?GAATTC? 切割后產(chǎn)生?CTTAAG?、?G 和 AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對(duì)的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)，即?G-OH和?CTTAA-P。 有的限制性酶識(shí)別四堿基對(duì)的順序，如 San3A識(shí)別?GATC ?；有的識(shí)別六 堿基對(duì)，如上述的ECOR I。識(shí)別四堿基對(duì)的內(nèi)切酶由于識(shí)別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識(shí)別八堿基對(duì)的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識(shí)別和切割位點(diǎn)更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。 ＋ 限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。 商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時(shí)內(nèi)完全酶解1μg DNA的酶量）。 三、實(shí)驗(yàn)材料 待酶切的DNA樣品 四、實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑 1、儀器：可調(diào)微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)燈 2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架 3、試劑：標(biāo)準(zhǔn)DNA(Marker) EcoRI限制性內(nèi)切酶 10×buffer：50mmol/l NaCl 10mmol/l Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/l MgCl2 lmmol/l DTT（二硫蘇糖醇） 五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、將DNA樣品8.5μl(質(zhì)粒pEGFP, 1μg) 2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。 3、加入1u（0.5μl）的限制性內(nèi)切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質(zhì)，吸完后盡快放回冰箱）。 4、混勻反應(yīng)液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時(shí)。 5、進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果，100V 25分鐘。 6、紫外燈下觀察消化效果。 六、注意事項(xiàng) 1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)大多為微量操作，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性以保證酶切效果最佳?，F(xiàn)介紹三種微量取樣方法： (1)吸樣時(shí)，將Tip尖剛剛接觸到液面時(shí)，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會(huì)沾上很多的樣品，導(dǎo)致吸樣不準(zhǔn)。 (2)用1cm長(zhǎng)的塑料毛細(xì)管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。 (3)目前也有細(xì)長(zhǎng)Tip出售，專門用于吸取微量樣品。 2、限制性內(nèi)切酶價(jià)格比較貴，因此要注意不使其污染而導(dǎo)致浪費(fèi)。這就要求每次吸酶時(shí)要用新的無(wú)菌Tip。另一個(gè)造成限制性內(nèi)切酶浪費(fèi)的因素就是限制性內(nèi)切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項(xiàng)試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內(nèi)切酶拿出冰箱的時(shí)間盡可能短。 若用同一酶消化很多樣品時(shí)，可先計(jì)算出所需酶量（可稍多計(jì)一點(diǎn)），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。這樣可節(jié)約用酶且縮短操作過程、減少污染機(jī)會(huì)。 3、開啟Eppendorf管時(shí)，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防雜酶污染。 4、樣品在37℃與65℃保溫時(shí)，要注意將Eppendorf管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。 5、無(wú)實(shí)驗(yàn)必要應(yīng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間酶消化樣品。因長(zhǎng)時(shí)間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。 七、習(xí)題 1、限制性核酸內(nèi)切酶天然存在于什么生物體內(nèi)？ 2、什么是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)？限制-修飾系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌有什么用途？ 3、限制性內(nèi)切酶有幾類？這幾類限制性內(nèi)切酶各有什么特點(diǎn)？可作為工具酶的限制性內(nèi)切酶是哪一類？為什么？ 4、限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列有什么特點(diǎn)？稱為什么序列？ 5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會(huì)結(jié)凍？酶最后工作的時(shí)候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個(gè)單位（1 U）的限制性內(nèi)切酶代表什么意思？ 實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p> 掌握熱激法或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒DNA；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。 二、實(shí)驗(yàn)原理 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。 （1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。 （2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1、制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中； 2、取出1管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化； 3、每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘； 4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管； 5、冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘； 6、復(fù)蘇：每管加400 μl LB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動(dòng)溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇； 7、布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板； 8、培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時(shí)即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。 四、結(jié)果與分析 計(jì)算轉(zhuǎn)化效率 菌落數(shù)/DNA質(zhì)量（μg）*稀釋倍數(shù) 五、習(xí)題 1、制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵是什么？ 2、如果DNA轉(zhuǎn)化后，沒有得到轉(zhuǎn)化子或者轉(zhuǎn)化子很少，分析原因。 3、如何提高轉(zhuǎn)化效率？ 分子生物學(xué)課程教學(xué)改革初探 摘要：文章總結(jié)了在十余年分子生物學(xué)教學(xué)過程中，不斷開展的對(duì)教師自身綜合素質(zhì)和能力、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和教學(xué)手段的改革探索，旨在提高分子生物學(xué)的教學(xué)效果。實(shí)踐證實(shí)，新的教學(xué)模式，在傳授學(xué)生專業(yè)知識(shí)的同時(shí)，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，改進(jìn)了學(xué)生的學(xué)習(xí)方法，也逐步提高了學(xué)生的自主學(xué)習(xí)能力，從而滿足了社會(huì)對(duì)高素質(zhì)創(chuàng)新型生物人才的需求。 關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；課程教學(xué)；改革研究；創(chuàng)新生物學(xué)人才 中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）26-0128-03 前言： 分子生物學(xué)的目標(biāo)是在分子水平上闡明細(xì)胞活動(dòng)的規(guī)律，從而揭示生命的本質(zhì)[1]。雖然它在生物類專業(yè)課程體系中充當(dāng)著重要角色，對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，但是分子生物學(xué)的教學(xué)卻因?yàn)檎n程內(nèi)容多，學(xué)科交叉廣，理解難度高，信息量大，知識(shí)更新快而使教學(xué)效果差強(qiáng)人意，集中表現(xiàn)為教師授課難和學(xué)生學(xué)習(xí)難。這種現(xiàn)狀不但困擾著老師和同學(xué)，也與大學(xué)培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新型人才的目標(biāo)不相適應(yīng)。如何克服分子生物學(xué)課堂教學(xué)的“瓶頸”？本人在從事十多年的分子生物學(xué)教學(xué)過程中，努力研究和探索多種形式的教學(xué)改革，力求提升教學(xué)效果和教學(xué)質(zhì)量。 一、教學(xué)內(nèi)容的合理組織 分子生物學(xué)的教學(xué)除了選用好的教材，制定完善的教學(xué)大綱，如何組織教學(xué)內(nèi)容是教學(xué)的一個(gè)非常重要環(huán)節(jié)[2]。教學(xué)內(nèi)容呈現(xiàn)給學(xué)生的應(yīng)該是完整、清晰的、有層次、條理的知識(shí)。我們?cè)诮M織教學(xué)的過程中，首先從提高自身學(xué)科素養(yǎng)著手?！耙槐窘滩臅?，數(shù)種參考書”，除分子生物學(xué)國(guó)內(nèi)、國(guó)外各類版本外，與分子生物學(xué)相互交叉和滲透的其他學(xué)科，如細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)，我們也都進(jìn)行了系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和強(qiáng)化，不斷夯實(shí)專業(yè)知識(shí)、拓展專業(yè)領(lǐng)域，基本構(gòu)建了分子生物學(xué)完整的知識(shí)體系，具備了對(duì)教材處理的前提。既避免了教學(xué)中各學(xué)科的重復(fù)，也進(jìn)一步凝練了知識(shí)。此外，我們還通過網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)向全國(guó)優(yōu)秀教師學(xué)習(xí)，在不斷的探索中總結(jié)出了教學(xué)內(nèi)容合理組織的一些思路。 1.思維導(dǎo)學(xué)模式。在DNA復(fù)制教學(xué)環(huán)節(jié)，知識(shí)點(diǎn)多，并且較分散，很容易在教學(xué)中造成學(xué)習(xí)困難和知識(shí)混淆的現(xiàn)象，針對(duì)這章教學(xué)的特點(diǎn)，我們采用了思維導(dǎo)學(xué)模式，收到了非常好的教學(xué)效果。 2.重點(diǎn)、難點(diǎn)解讀。本科教學(xué)形式多樣化，也更提倡學(xué)生的自主學(xué)習(xí)，但并不是淡化了教師的教學(xué)，反而對(duì)教師提出了更高的要求[3]。教師必須圍繞每堂課的教學(xué)目的，合理組織和引導(dǎo)學(xué)生理解并掌握教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容。 比如在講解染色體端粒末端修復(fù)機(jī)制中，教師首先要從教材的知識(shí)結(jié)構(gòu)中梳理出重點(diǎn)。染色體端粒末端修復(fù)機(jī)制的知識(shí)點(diǎn)包括：（1）引物切除造成的遺傳信息缺失；（2）端粒末端的特點(diǎn)；（3）體細(xì)胞和性細(xì)胞末端修復(fù)機(jī)制的不同；（4）DNA結(jié)構(gòu)的變化；（5）端粒酶的修復(fù)機(jī)制。梳理知識(shí)點(diǎn)后，總結(jié)教學(xué)重點(diǎn)：一是引物切除后損傷修復(fù)在體細(xì)胞和性細(xì)胞中的不同；二是四鏈DNA結(jié)構(gòu)；三是端粒酶的修復(fù)機(jī)制。其中端粒酶修復(fù)機(jī)制的講授是學(xué)生學(xué)習(xí)的難點(diǎn)。難點(diǎn)集中在端粒酶的性質(zhì)和修復(fù)發(fā)生的過程。 經(jīng)過對(duì)教學(xué)內(nèi)容中重點(diǎn)和難點(diǎn)的準(zhǔn)確把握和合理組織，教師才能在課堂教學(xué)中突出重點(diǎn)、突破難點(diǎn)，讓學(xué)生的課堂學(xué)習(xí)無(wú)障礙。 二、教學(xué)方法和手段的改進(jìn) 教學(xué)方法的推陳出新，是教學(xué)改革的重要內(nèi)容[4]。為發(fā)揮學(xué)生作為教學(xué)主體的能動(dòng)性，我們根據(jù)具體的教學(xué)內(nèi)容設(shè)置了啟發(fā)式、聯(lián)想式、探究式等多種教學(xué)方法[5]，讓學(xué)生參與到教學(xué)過程中，不僅活躍了課堂氣氛，而且在分享知識(shí)的同時(shí)，更注重教會(huì)學(xué)生靈活掌握學(xué)習(xí)的方法。 1.啟發(fā)式教學(xué)。啟發(fā)的目的在于舉一反三，觸類旁通。針對(duì)每一次的課堂教學(xué)，設(shè)計(jì)一些拋磚引玉的問題，供學(xué)生思考與討論，這成為了分子生物學(xué)理論教學(xué)的重要組成部分。如進(jìn)行到真核生物基因表達(dá)調(diào)控學(xué)習(xí)環(huán)節(jié)，提出甲基化修飾的生物學(xué)意義，這個(gè)問題覆蓋范圍廣，涉及到了DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)和DNA甲基化修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，以及Epigenetic（表觀遺傳學(xué)）方面的知識(shí)。通過提出問題―討論分析―不斷啟發(fā)―再討論分析―歸納總結(jié)―解決問題這一系列的互動(dòng)教學(xué)活動(dòng)，充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生課堂學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，在不斷的討論分析中通過展示不同的思維、發(fā)表各自的觀點(diǎn)，不但有利于促進(jìn)學(xué)生在學(xué)習(xí)中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題，而且有利于學(xué)生通過對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的消化、理解來達(dá)到理論的升華、拓展[4]。 2.聯(lián)想式教學(xué)。分子生物學(xué)是在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來[6]，因此知識(shí)相互交叉、相互滲透。在授課的過程中，教師一方面要避免重復(fù)，一方面要通過聯(lián)想知識(shí)點(diǎn)適時(shí)培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)散性思維，提高學(xué)生對(duì)知識(shí)的遷移能力和整合能力。如在講解化學(xué)修飾對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控時(shí)，將細(xì)胞生物學(xué)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有機(jī)結(jié)合，使學(xué)生了解基因表達(dá)調(diào)控對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制。 3.探究式教學(xué)。在分子生物學(xué)教學(xué)中，每一個(gè)理論知識(shí)的背后都是科學(xué)研究的重大突破。如確定遺傳物質(zhì)是DNA的兩大經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，我們以探究的形式呈現(xiàn)教學(xué)內(nèi)容，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，到結(jié)果顯示，再經(jīng)過討論分析并得出結(jié)論，以課題研究的角度，研究人員的身份引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入學(xué)習(xí)角色，將學(xué)科概念、理論產(chǎn)生的起因和過程展示給學(xué)生，啟發(fā)學(xué)生努力探索，走近科學(xué)，讓學(xué)生從中領(lǐng)悟知識(shí)形成的探究性和科學(xué)性，逐漸培養(yǎng)具有創(chuàng)新意識(shí)和能力的高素質(zhì)研究型人才。 4.多媒體多樣化教學(xué)。分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容具有微觀性、復(fù)雜性、抽象性和動(dòng)態(tài)性。傳統(tǒng)的教學(xué)手段無(wú)法滿足教學(xué)的需求，而多媒體技術(shù)則具有聲像俱佳、動(dòng)靜皆宜的特點(diǎn)[7]，是傳統(tǒng)教學(xué)無(wú)法比擬的。多年來我們不斷補(bǔ)充和完善教學(xué)手段，逐漸形成了獨(dú)具特色的多媒體教學(xué)課件。 多媒體圖像處理清晰直觀，文字表述簡(jiǎn)潔明了、主題突出。課件中的圖像來源于國(guó)內(nèi)外的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)。如講述DNA半保留復(fù)制機(jī)理時(shí)[8]，首先將DNA可能存在的幾種復(fù)制方式用圖像展現(xiàn)，并利用Meselson和Stahl設(shè)計(jì)的DNA復(fù)制同位素示蹤實(shí)驗(yàn)和密度梯度離心實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，引導(dǎo)學(xué)生明確掌握DNA半保留復(fù)制特點(diǎn)，并結(jié)合文字，通過圖文并茂的多媒體課件，將教學(xué)內(nèi)容中的背景知識(shí)、基本概念、基本理論，以及靜態(tài)、抽象的微觀知識(shí)清晰講解。 多媒體課件動(dòng)靜結(jié)合、聲像互動(dòng)。對(duì)于生命過程中動(dòng)態(tài)的知識(shí)點(diǎn)，比如DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的翻譯過程，可以將這些復(fù)雜的生命過程利用多媒體手段做成動(dòng)畫并配以文字和聲像，形象直觀地展現(xiàn)給學(xué)生，既加深了學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解，也提高了其學(xué)習(xí)效率。 三、知識(shí)領(lǐng)域的拓展 分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容除包含基礎(chǔ)理論知識(shí)外，還有大量理論應(yīng)用的研究方法部分。我們?cè)诮虒W(xué)中不僅僅將知識(shí)局限在教材中，利用課堂教學(xué)不斷引導(dǎo)學(xué)生去了解本學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)、最新進(jìn)展、發(fā)展趨勢(shì)[8]，以及生物技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。 1.專題講座與專題討論。專題講座是教師根據(jù)教學(xué)內(nèi)容，自己組織參考資料對(duì)教學(xué)內(nèi)容的延伸與拓展。比如在講授“SNP技術(shù)”時(shí)，先從遺傳標(biāo)記分析的發(fā)展著手，把一代、二代的標(biāo)記分析做知識(shí)性的回顧，再將納入教材的第三代標(biāo)記分析“SNP”做詳細(xì)的講解，引導(dǎo)大家理解什么是單核苷酸多態(tài)性，核苷酸多態(tài)性研究的生物學(xué)意義以及在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧等多種領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用。通過這種方式激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情和求知欲，也使教師不斷地進(jìn)行知識(shí)的更新，及時(shí)了解本學(xué)科當(dāng)前發(fā)展的趨勢(shì)、研究的熱點(diǎn)以及爭(zhēng)論的問題。 專題討論則是以學(xué)生為主體，根據(jù)課程教學(xué)內(nèi)容，組織學(xué)生就某一個(gè)專題自行查閱、組織文獻(xiàn)資料，并在課堂上展開討論[9]。比如在講授基因重組的教學(xué)內(nèi)容時(shí)，設(shè)計(jì)“轉(zhuǎn)基因的利與弊”供學(xué)生討論。引導(dǎo)學(xué)生思考基因工程藥物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物對(duì)社會(huì)產(chǎn)生的巨大影響，讓知識(shí)離開課本走進(jìn)生活，從而喚起學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和探索未知領(lǐng)域的欲望。這不僅使學(xué)生更加深入、系統(tǒng)地理解所學(xué)知識(shí)，并且培養(yǎng)了學(xué)生靈活運(yùn)用知識(shí)的能力[10]。 2.生物信息技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)。生物信息技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為分子生物學(xué)研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技術(shù)”的專題講座中，不僅要對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、操作以及?yīng)用進(jìn)行講解，還要特別對(duì)引物設(shè)計(jì)的生物信息技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充，介紹學(xué)生對(duì)一些常規(guī)的生物信息技術(shù)軟件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAStar、Cluster等有一個(gè)基本的認(rèn)知度。 在整個(gè)分子生物學(xué)的教學(xué)中，學(xué)生需要自行查閱和組織各種文獻(xiàn)資料，因此，必須特別強(qiáng)調(diào)互聯(lián)網(wǎng)資源運(yùn)用的重要性。教師通過介紹中國(guó)知網(wǎng)、維普、清華同方、NCBI等幾個(gè)常用資源庫(kù)，使學(xué)生了解如何利用資源庫(kù)進(jìn)行查詢，對(duì)互聯(lián)網(wǎng)資源的熟練應(yīng)用使學(xué)生的知識(shí)體系得以完善，學(xué)生通過自身的努力來提高信息收集和辨別的能力，培養(yǎng)了學(xué)生的自學(xué)能力。 四、教學(xué)改革中應(yīng)該注意的問題 1.教師的專業(yè)修養(yǎng)與教學(xué)基本功。教師在教學(xué)中具有雙重身份，既是一名導(dǎo)演，又是一名演員。作為導(dǎo)演，首先需要有最新的教學(xué)理念，整個(gè)教學(xué)過程中適時(shí)設(shè)問、適時(shí)討論、適時(shí)啟發(fā)。其次要有較強(qiáng)的課堂組織能力，根據(jù)學(xué)生的學(xué)習(xí)情況，把握課堂節(jié)奏，調(diào)動(dòng)學(xué)生課堂學(xué)習(xí)激情，使教學(xué)有的放矢。否則會(huì)在教學(xué)中出現(xiàn)“啟而不發(fā)”和論證條理不清的現(xiàn)象；作為演員，還要有良好的課程駕馭能力，通過教師扎實(shí)的專業(yè)知識(shí)、廣泛的認(rèn)知領(lǐng)域、全面的知識(shí)結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)給學(xué)生的是一個(gè)豐盛的知識(shí)大餐，而不是一鍋夾生飯。因此作為教師，必須從理論水平、科研水平、思維水平這3個(gè)方面提高教師自身的專業(yè)素質(zhì)，此外，還要掌握適合自己的各項(xiàng)教學(xué)技能。 2.多媒體教學(xué)的合理應(yīng)用。多媒體教學(xué)只是一種提高教學(xué)效果的輔助手段，是為教師的教學(xué)和學(xué)生的學(xué)習(xí)服務(wù)的，只有運(yùn)用合理才可能達(dá)到好的效果。因此盡量避免在多媒體教學(xué)課件上出現(xiàn)過多的文字，否則多媒體成了教學(xué)活動(dòng)中的主體，老師由照本宣科轉(zhuǎn)變?yōu)榘缪莘庞硢T和播音員的角色。學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣不高，教學(xué)效果也就適得其反。多媒體和傳統(tǒng)教學(xué)只有合理地結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，才能在課堂教學(xué)中體現(xiàn)出其真正的價(jià)值。 總之，教學(xué)改革的目標(biāo)是幫助學(xué)生建立學(xué)科知識(shí)體系，培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)素養(yǎng)，提升學(xué)生后繼學(xué)習(xí)的能力。正如葉圣陶先生所說：“教師的教學(xué)，不在于給學(xué)生搬去可以致富的金子。而在于給學(xué)生點(diǎn)金的指頭?！蹦壳埃覀冴P(guān)于分子生物學(xué)課堂教學(xué)改革還處于不斷探索和實(shí)踐階段，除了需要不斷地提高教師自身的學(xué)科修養(yǎng)和科研素質(zhì)外，也以“夯實(shí)基礎(chǔ)、拓展知識(shí)、增強(qiáng)能力、提高素質(zhì)”[8]作為教學(xué)的目的和人才培養(yǎng)目標(biāo)，努力在今后把教學(xué)工作開展得更加有生有色，為社會(huì)培養(yǎng)更多高素質(zhì)創(chuàng)新型人才。 參考文獻(xiàn)： 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分子生物學(xué)是一門從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命的本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是分子生物學(xué)的一個(gè)重要分支，是從分子水平研究人體在正常及疾病狀態(tài)下生命活動(dòng)及其規(guī)律的一門科學(xué)。它主要研究人體生物大分子和大分子體系的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用及其同疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。作為一門課程，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)涵蓋了醫(yī)學(xué)各專業(yè)學(xué)生必須學(xué)習(xí)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，以及分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中形成的專門研究領(lǐng)域及相關(guān)知識(shí)。 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)既要較系統(tǒng)地了解分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論知識(shí)和技術(shù)理論知識(shí)，同時(shí)也要了解分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和相關(guān)研究進(jìn)展。 本書共二十三章，包括5個(gè)方面內(nèi)容。第二章至第十章介紹分子生物學(xué)基本知識(shí)，主要介紹基因和基因組的基本概念和基本特點(diǎn)，基因組核酸復(fù)制與損傷修復(fù)、基因表達(dá)和功能蛋白形成與降解、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞間通訊與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本概念和基本理論，細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制。第十一章至第十三章介紹基因操作的基本知識(shí)，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆與表達(dá)的相關(guān)基本知識(shí)和研究策略。第十四章至第十八章介紹疾病分子生物學(xué)機(jī)制，介紹了基因和基因組、細(xì)胞間通訊和信號(hào)與人類健康和疾病之間關(guān)系。第十九章至第二十一章介紹分子生物學(xué)理論與技術(shù)在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，包括基因診斷和基因治療概念與相關(guān)研究。最后兩章介紹分子生物學(xué)新興研究領(lǐng)域、生物信息學(xué)在基因和蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用。 本大綱正是從上述目的出發(fā)，在要求學(xué)生掌握分子生物學(xué)基本知識(shí)與基本技術(shù)，同時(shí)了解分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與相關(guān)研究。使學(xué)生們?cè)诜肿铀缴涎芯咳梭w在正常及疾病狀態(tài)下生命活動(dòng)及其規(guī)律，為從事臨床醫(yī)學(xué)打下深厚的基礎(chǔ)。 緒 論 一、目的要求 了解分子生物學(xué)的定義、研究對(duì)象和研究?jī)?nèi)容；分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史；生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)；現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和深入發(fā)展；分子生物學(xué)與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系；分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用。 二、主要內(nèi)容 分子生物學(xué)則是從分子水平研究生命現(xiàn)象及其規(guī)律的一門新興學(xué)科。它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能為研究對(duì)象 （一）、分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容 分子生物學(xué)主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、生物大分子之間的相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)方面。1.核酸分子生物學(xué) 2.蛋白質(zhì)分子生物學(xué) 3.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) （二）、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史 1、生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 2、現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立 3、現(xiàn)代分子生物學(xué)的深入發(fā)展 （三）、分子生物學(xué)與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系 由于生命本質(zhì)的高度一致性，分子生物學(xué)已經(jīng)對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了全面而深刻的影響，并逐步形成了一系列的分子學(xué)科?？梢允褂猛惶桌碚?、同一套技術(shù)，來解釋和研究不同的病理、生理現(xiàn)象，甚至治療不同的疾病。 1、分子生物學(xué)與生物化學(xué) 2、細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué) 3、分子生物學(xué)與遺傳學(xué) 4、分子生物學(xué)與生物技術(shù) （四）、分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)未來 分子生物學(xué)的發(fā)展和滲透從根本上改變了醫(yī)學(xué)（包括臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)）各個(gè)學(xué)科的格局, 使醫(yī)學(xué)各學(xué)科進(jìn)入了一個(gè)更高的水平——分子水平。 1、分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用 2、分子生物學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 3、分子生物學(xué)和病理學(xué) 4、分子生物學(xué)和疾病診斷 5、分子生物學(xué)和疾病治療 基因治療技術(shù)的發(fā)展與整個(gè)醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展以及許多分子生物學(xué)新理論、新技術(shù)、新方法的應(yīng)用密切相關(guān)。 所謂基因治療，就是用正?；蛑脫Q致病基因以糾正患者基因結(jié)構(gòu)和功能異常的一種疾病治療的方法。 狹義的基因治療是指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。廣義的基因治療則包括通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，使目的基因得到表達(dá)，封閉、剪切致病基因的mRNA，或自殺基因產(chǎn)物催化藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性物質(zhì)，殺死腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療疾病的目的。 三、學(xué)時(shí)安排 1學(xué)時(shí) 第二章 基因與基因組 一、目的要求： （一）掌握：基因的概念及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；中心法則；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)序列；多順反子，單順反子；真核基因與原核基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?；蚪M的概念；病毒、細(xì)菌及真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。 （二）熟悉：基因突變的意義，基因組變異的生理和病理學(xué)意義。 （三）了解：基因的命名法，基因組學(xué)；人類基因組計(jì)劃。 二、主要內(nèi)容 基因是負(fù)責(zé)編碼RNA或一條多肽鏈的DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側(cè)翼序列及插入序列。編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列稱為結(jié)構(gòu)基因。原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的，其RNA合成后不需要經(jīng)過剪接加工。而大多數(shù)真核生物基因在編碼區(qū)內(nèi)有非編碼的插入序列?；蛑泻信c轉(zhuǎn)錄有關(guān)調(diào)控序列。真核生物基因中調(diào)控序列一般稱為順式作用元件。 大多數(shù)生物的遺傳信息都是以特定的核苷酸排列順序貯存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作為遺傳物質(zhì)。多數(shù)生物信息按照從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的方向流。但是對(duì)RNA病毒是以RNA為模板，合成單鏈DNA，然后再合成雙鏈DNA。 mRNA將DNA中信息傳遞給蛋白質(zhì)。在mRNA編碼區(qū)內(nèi)每三個(gè)連續(xù)核苷酸，對(duì)應(yīng)多肽鏈一個(gè)氨基酸，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。原核生物mRNA稱多順反子mRNA，而真核生物mRNA稱單順反子mRNA。 基因突變?cè)谶M(jìn)化上具有重要意義，它是形成生物多樣性主要因素之一。同時(shí)基因突變可以改變遺傳信息，導(dǎo)致疾病。導(dǎo)致基因突變因素有自發(fā)、物理、化學(xué)因素等，基因突變可直接影響蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疾病或?qū)膊∫赘小?/p> 基因命名的基本原則是簡(jiǎn)明、獨(dú)特、能夠表達(dá)基因的特征或功能。基因符號(hào)的命名也應(yīng)遵循獨(dú)特、簡(jiǎn)短、僅含有大寫拉丁字母或大寫字母和阿拉伯?dāng)?shù)字、不應(yīng)含有標(biāo)點(diǎn)符號(hào)的基本原則。 1．重點(diǎn)內(nèi)容：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)序列；多順反子，單順反子；基因組的概念；病毒、細(xì)菌及真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。 2．難點(diǎn)內(nèi)容：基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。 三、學(xué)時(shí)安排 5學(xué)時(shí) 第三章 基因表達(dá)與基因表達(dá)調(diào)控 一、目的要求： （一）掌握：遺傳信息表達(dá)，轉(zhuǎn)錄，翻譯，有意義鏈，轉(zhuǎn)錄模板鏈，開放閱讀框，遺傳密碼等基本概念?；虮磉_(dá)，管家基因，組成性基因表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)，阻遏表達(dá)，協(xié)調(diào)表達(dá)，表達(dá)調(diào)控，反式作用因子，表達(dá)組織特異性等基本概念；乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。 （二）熟悉：原核生物RNA和蛋白質(zhì)的生物合成基本過程，真核生物RNA和蛋白質(zhì)合成特點(diǎn)；真核生物基因表達(dá)調(diào)控的各個(gè)水平，DNA水平調(diào)控的不同方式，反式作用因子的主要特點(diǎn)和調(diào)節(jié)方式，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的不同環(huán)節(jié)，翻譯水平和翻譯后水平調(diào)控的基本環(huán)節(jié) （三）、了解：了解轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工。反式作用因子結(jié)構(gòu)域模式和反式作用因子的作用方式，基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)相性。 二、主要內(nèi)容 原核生物基因表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及啟動(dòng)子、S因子、阻遏蛋白、正調(diào)控蛋白等多種因素，翻譯水平的調(diào)控則涉及SD序列、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯產(chǎn)物的調(diào)控。 真核生物基因表達(dá)調(diào)控環(huán)節(jié)較多，在DNA水平可通過染色體丟失、基因擴(kuò)增、基因重排、DNA甲基化以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變影響基因表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄水平則主要通過反式作用因子的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與TATA盒的結(jié)合、RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成；在轉(zhuǎn)錄后水平主要通過RNA修飾、剪接及mRNA運(yùn)輸?shù)目刂苼碛绊懟虮磉_(dá)；影響翻譯水平的因素有影響翻譯起始的陰遏蛋白、5`AUG、5` 端非編碼區(qū)的長(zhǎng)度等，另外還存在小分子反義RNA對(duì)翻譯調(diào)控。翻譯后蛋白質(zhì)修飾和定位也是表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。 同時(shí)近年提出的有關(guān)基因表達(dá)的統(tǒng)一理論慚被認(rèn)識(shí)。從而形成一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 1、重點(diǎn)內(nèi)容： 原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制；真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制；真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制。 2、難點(diǎn)內(nèi)容： 原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。 三、學(xué)時(shí)安排 4學(xué)時(shí) 第四章 基因分析的基本策略 一、目的要求 （一）掌握：Southern 雜交和PCR等技術(shù)原理及在分析基因拷貝數(shù)的應(yīng)用；Northern blot和RT-PCR技術(shù)原理及在基因轉(zhuǎn)錄水平變化分析中的應(yīng)用； （二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用。 （三）了解：DNA序列測(cè)定的原理及其主要應(yīng)用；RNA酶保護(hù)試驗(yàn)原理及應(yīng)用；原位雜交技術(shù)；DNA微陣列技術(shù)原理； 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用；免疫 組化方法的應(yīng)用。 二、主要內(nèi)容 基因分析是一種策略性很強(qiáng)的工作，有許多技術(shù)可以用于基因分析，正確選擇實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和基因分析切入點(diǎn)是進(jìn)行基因分析首先要考慮的問題。根據(jù)信息中心法則，DNA是遺傳信息的攜帶者，RNA是基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)基因的最終產(chǎn)物，因此，分析基因可從DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行。同時(shí)研究者善于將各種技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，根據(jù)研究目的篩選適當(dāng)技術(shù)方法，也可先制定研究策略，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線設(shè)計(jì)。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：Southern 雜交和PCR等技術(shù)原理及應(yīng)用；Northern blot和RT-PCR技術(shù)原理及應(yīng)用Western blot 原理及應(yīng)用。 2、難點(diǎn)內(nèi)容：RNA酶保護(hù)試驗(yàn)原理及應(yīng)用。 三、學(xué)時(shí)安排 3學(xué)時(shí) 第五章基因功能分析的基本策略 一、目的要求 （一）掌握：轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技術(shù)原理、利用基因沉默技術(shù)對(duì)基因功能進(jìn)行分析的原理 （二）了解；三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作過程及注意事項(xiàng) 二、主要內(nèi)容 基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平上采用不同的技術(shù)和模 型來實(shí)現(xiàn)。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除技術(shù)是目前研究特定基因功能最常用的動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)染細(xì)胞是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的細(xì)胞模型。RNA干涉技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在RNA水平上暫時(shí)關(guān)閉特定基因的方法。各種方法都具有各自的特點(diǎn)及局限性，研究者可根據(jù)不同目的篩選最合適方法與模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因功能的研究目的。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)及RNA干涉技術(shù)原理 2、難點(diǎn)內(nèi)容：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)及RNA干涉技術(shù)各自優(yōu)點(diǎn)及局限性 三、學(xué)時(shí)安排 3學(xué)時(shí) 第六章 基因工程與體外表達(dá) 一、目的要求： （一）、掌握：常用克隆載體；基因克隆的基本過程；外源基因在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的原理和方法。 （二）、熟悉：限制性核酸內(nèi)切酶和其他常用工具酶的概念和特點(diǎn)；定點(diǎn)誘變技術(shù)原理。 （三）、了解：昆蟲表達(dá)系統(tǒng)；酵母表達(dá)系統(tǒng)。 二、主要內(nèi)容： 基因工程指在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的與方案進(jìn)行剪切和重新連接，或?qū)NA中某個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除，改造基因結(jié)構(gòu)，然 后利用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染等方法將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使DNA片段得到擴(kuò)增。DNA的體外剪切和重新連接是在限制性核酸內(nèi)切酶、邊接酶以及其他修飾酶的參與下進(jìn)行的。不同目的的克隆基因需要不同的載體，常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和粘性質(zhì)粒等。載體可與外源DNA在體外連接，構(gòu)成重組DNA分子，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，能在宿主細(xì)胞中自行復(fù)制與表達(dá)。 克隆的基因可進(jìn)一步用于表達(dá)有關(guān)基因的產(chǎn)物，進(jìn)行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子以及基因的功能等。還可通過寡核苷酸介導(dǎo)法、含U模板法、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法等技術(shù)，定向改變克隆基因的序列結(jié)構(gòu)，從而改造相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)。 基因工程在得到重組體后，通常利用大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因的體外表達(dá)。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：基因克隆的基本操作過程。 2、難點(diǎn)內(nèi)容：α－互補(bǔ)篩選；陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選；定點(diǎn)誘變技術(shù)原理。 三、學(xué)時(shí)安排： 6學(xué)時(shí) 第七章 基因診斷(自學(xué)) 一、目的要求： （一）掌握：基因診斷的基本概念；掌握基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)——核酸分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測(cè)、限制性酶酶譜分析、DNA序列測(cè)定、DNA 芯片技術(shù)； （二）熟悉基因診斷的基本方法； （三）了解遺傳病、感染性疾病以及腫瘤的基因診斷的策略；了解基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。 二、主要內(nèi)容： 基因診斷已成為臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分。PCR擴(kuò)增和分子雜交是現(xiàn)代基因診斷技術(shù)的基本方法，基因診斷的基本操作流程是：樣本抽提、樣本擴(kuò)增、分子雜交和信號(hào)檢測(cè)。遺傳病的基因診斷主要是針對(duì)DNA分子的遺傳分析技術(shù)，其基本方法學(xué)包括連鎖分析和直接診斷。用作連鎖分析的遺傳標(biāo)志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遺傳分析的代表性直接診斷技術(shù)有：用于DNA制圖的Southern印跡法、用于檢測(cè)點(diǎn)突變的ASO分子雜交法以及用于識(shí)別STR序列的PCR直接擴(kuò)增法等。同時(shí)基因診斷技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代法醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：各種檢測(cè)方法原理 2、難點(diǎn)內(nèi)容：各自優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn) 三、學(xué)時(shí)安排 3學(xué)時(shí) 第八章 基因治療(自學(xué)) 一、目的要求： （一）掌握：基因治療、基因標(biāo)記、基因置換、基因添加、基因干預(yù)、反義RNA、核酶等基本概念； （二）熟悉：基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體的特點(diǎn)；熟悉腫瘤基因治療思路，理解抑癌基因治療原理、實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)及腫瘤的免疫基因治療；理解反義RNA在基因治療中的意義和應(yīng)用； （三）了解：了解其它基因轉(zhuǎn)移方法；了解核酶及三鏈DNA在基因治療中的意義和基本原理；了解基因治療的前景與問題。 二、主要內(nèi)容 基因治療是指以改變?nèi)祟愡z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)學(xué)治療，即通過一定方式將人正?；蛞吧突蚧蛴兄委熥饔玫腄NA順序?qū)肴梭w靶細(xì)胞，以矯正或轉(zhuǎn)換致病基因的治療方法。目前開展基因治療方案采取的策略包括：用正?；蛑脫Q染色體上致病基因，將正常基因轉(zhuǎn)移至患者的宿主細(xì)胞，使治療基因代替致病基因表達(dá)正常蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用；向患者體內(nèi)或腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抑制基因，以抑制其表達(dá)；也可用反義RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封閉有害基因mRNA表達(dá)；也可將抗體、細(xì)胞因子等基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞活力，增強(qiáng)患者免疫力。 治療基因?qū)塍w內(nèi)方法有非病毒方法與病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)法，其方法安全性好但效率低。與病毒方法各具有不同優(yōu)缺點(diǎn)。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：基因治療概念、基因治療策略方法、2、難點(diǎn)內(nèi)容：治療基因?qū)塍w內(nèi)方法，各自優(yōu)缺點(diǎn)、病毒載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；核酶及三鏈DNA在基因治療的原理 三、學(xué)時(shí)安排 3學(xué)時(shí) 第九章 基因組學(xué)與醫(yī)學(xué)(自學(xué)) 一、目的求： （一）掌握：基因組學(xué)、人類基因組計(jì)劃、基因病和SNP的概念；結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)的概念及研究?jī)?nèi)容。 （二）熟悉：比較基因組學(xué)的概念；疾病相關(guān)基因的鑒定策略。 （三）了解：基因組學(xué)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。 二、主要內(nèi)容 人類基因組計(jì)劃的研究目標(biāo)是闡明構(gòu)成人類基因組的全部DNA的結(jié)構(gòu)；闡明基因的編碼方式和分布特點(diǎn)；理解基因及其調(diào)控序列之間的相互關(guān)系；理解DNA全部序列所蘊(yùn)藏的意義。該計(jì)劃包括為遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜分析。 功能基因組學(xué)是研究基因組中所有基因功能的學(xué)科。功能基因組學(xué)是從基因整體水平對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行探討，其研究?jī)?nèi)容主要包括基因組的表達(dá)、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能、基因組多樣性的研究、基因組功能注釋。 1、重點(diǎn)內(nèi)容：人類基因組計(jì)劃、功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容。 2、難點(diǎn)內(nèi)容：功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容。 三、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí) 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及學(xué)時(shí)安排 1大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取 3學(xué)時(shí) 2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 3學(xué)時(shí) 3 DNA純度、濃度和分子量的測(cè)定 4學(xué)時(shí) 4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化 4學(xué)時(shí) 5動(dòng)植物基因組DNA的提取與純化 4學(xué)時(shí)第二篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)講義 朱玉賢
第三篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義
第四篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)改革初探
第五篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)大綱
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