第一篇：細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功與否的八大要素

細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功與否的八大要素

摘要 : 轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此)，需要被轉(zhuǎn)染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于

知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。做細(xì)胞轉(zhuǎn)染也一樣道理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此)，需要被轉(zhuǎn)染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，以下八個(gè)要素都不容忽視。

要素一：細(xì)胞

分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過(guò)度生長(zhǎng)的狀態(tài);此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來(lái)活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對(duì)于貼壁細(xì)胞(如HEK，CHO)，懸浮細(xì)胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒(méi)有分子水平上合理機(jī)制的解釋。

分板方案——在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分板傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時(shí)間的長(zhǎng)短，胰蛋白酶的滅活等)需要優(yōu)化。

傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對(duì)一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi))。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力)性質(zhì)也可能會(huì)有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞數(shù)量(融合率)——只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間，細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對(duì)于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)并可互相疊加。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞會(huì)因受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及細(xì)胞溶解之前的生長(zhǎng)情況相關(guān)。

培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%，它可改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對(duì)采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺(jué)檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數(shù)的無(wú)菌濾膜;它們還對(duì)常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。

要素二：載體DNA

一般原則：對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照。

載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。

載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)毒素)可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

載體構(gòu)造(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可高效表達(dá)large T抗原(如，COS);而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。

除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。要素三：組織培養(yǎng)試劑

一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無(wú)機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。

胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。

添加劑——某些細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于一些對(duì)生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)(如，生長(zhǎng)因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。CO2培養(yǎng)箱——細(xì)胞生長(zhǎng)所需環(huán)境為37℃、相對(duì)濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值，細(xì)胞生理對(duì)pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來(lái)有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對(duì)一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異。來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理。

要素四：使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)生產(chǎn)蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白

以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集。而挑選這樣一個(gè)細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)速度大大超過(guò)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，就可獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)。

現(xiàn)將一些影響蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素分列如下： 細(xì)胞系(有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高)質(zhì)粒骨架(例如：增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)目的蛋白(有些蛋白很難獲得高表達(dá)量)目的蛋白的cDNA序列(例如：密碼子的優(yōu)化)培養(yǎng)條件(營(yíng)養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物)當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物(轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)粒)后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克隆。

要素五：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的第一步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來(lái)幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。

一旦選好了質(zhì)粒載體，無(wú)論瞬時(shí)或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維持對(duì)細(xì)胞的選擇壓力。

要素六：轉(zhuǎn)染方案

一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開(kāi)始，然后通過(guò)改變?cè)噭?DNA的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)?？捎脽o(wú)菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對(duì)于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。

轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比)——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)最為有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑——對(duì)于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入——有兩種替換方法可用來(lái)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1.將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡(jiǎn)便，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以會(huì)使結(jié)果的一致性更好。

要素七：時(shí)間進(jìn)度

一般原則提示：要確保最終結(jié)果的成功;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到最佳表達(dá)。轉(zhuǎn)染的開(kāi)始——在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100%的融合。細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后，就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長(zhǎng)。

培養(yǎng)基更換——某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒(méi)有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟就必不可少。而對(duì)于可在血清存在的情況下使用的無(wú)毒性轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在培養(yǎng)基中直到進(jìn)行檢測(cè)，那么對(duì)有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開(kāi)始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長(zhǎng)期生長(zhǎng)階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長(zhǎng)3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來(lái)就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量。

時(shí)間測(cè)定——轉(zhuǎn)染開(kāi)始后的24-48小時(shí)內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營(yíng)養(yǎng)因素等。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見(jiàn)了。

最后就是平時(shí)可能會(huì)忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect，轉(zhuǎn)染試劑本身對(duì)基因表達(dá)水平(高表達(dá)或低表達(dá))的影響，有時(shí)候可能會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果。

我自己的體會(huì)是，一般的細(xì)胞，用脂質(zhì)體2000和fugeneHD轉(zhuǎn)染效率相差不大，雖然最近有文獻(xiàn)說(shuō)脂質(zhì)體2000脫靶效應(yīng)很高，但國(guó)內(nèi)在乎的人貌似不多;但是干細(xì)胞，原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等一些比較難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，F(xiàn)ugene HD比較溫和，細(xì)胞毒性很低，轉(zhuǎn)染效率明顯要好;懸浮細(xì)胞，各有千秋，不敢說(shuō)一定可以，重在嘗試，要是都不行，就電轉(zhuǎn)吧。

要素八：交叉污染

如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。

作者：keeii 點(diǎn)擊：1087次

第二篇：細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選

篩選之前確定G418濃度： 1，由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。

2，G418 是新霉素的類似物，兩者都是通過(guò)抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對(duì)真核細(xì)胞無(wú)作用而G418對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。

3，匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過(guò)50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的 G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。一個(gè)具體試驗(yàn)：3*106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。加藥時(shí)間和維持濃度

1，由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。關(guān)于維持濃度，有人說(shuō)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽(yáng)性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。

篩選時(shí)的培養(yǎng)液

加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無(wú)幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題： 1，死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液，孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3 細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。3，適當(dāng)增加血清濃度。

篩選時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題及其解決辦法：

1，問(wèn)題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過(guò)程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開(kāi)，和周?chē)钠渌?xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說(shuō)幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒(méi)有辦法做下去了，該怎么辦？

a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤(rùn)洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

b、加入胰酶后，稍過(guò)幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；

c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開(kāi)，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀

d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果 步驟2中顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞尚未完全松散開(kāi)，可以再重復(fù)的，直到松散開(kāi)，能夠被吸走為止。

我的建議：

1、在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。

2、把細(xì)胞全部消化下來(lái)，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆

2，問(wèn)題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70－80％，但是想挑到表

達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個(gè)可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣故。

3，問(wèn)題3。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。想請(qǐng)教各位有經(jīng)驗(yàn)的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細(xì)胞。不過(guò)，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。

4，問(wèn)題4。單克隆化的時(shí)機(jī)和個(gè)數(shù)：加藥篩選時(shí), 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長(zhǎng)到70%以上時(shí),再做有限稀釋法, 以克隆出陽(yáng)性細(xì)胞, 同時(shí)要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?以防突變和污染。若細(xì)胞長(zhǎng)好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個(gè)克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見(jiàn)，篩10個(gè)吧。

5，從單克隆化時(shí)開(kāi)始，就要加大營(yíng)養(yǎng)，清和生長(zhǎng)因子。單克隆化的操作方法；

1.方法1。單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個(gè)96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時(shí)候應(yīng)保證每個(gè)孔中的細(xì)胞是一個(gè),因此,我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個(gè)的細(xì)胞,這樣平均到每個(gè)孔中因該可以由滿意的結(jié)果你所說(shuō)的現(xiàn)象我也遇到過(guò),我也百思不得其解,只好做多一點(diǎn)的96孔板來(lái)補(bǔ)充。培養(yǎng)SPC-A1（人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫(xiě)出來(lái)，希望對(duì)你有所幫助。

2.方法2。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對(duì)96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml /孔，從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細(xì)胞液，操作示意圖見(jiàn)下圖。一般來(lái)說(shuō)，每一列都會(huì)有某個(gè)孔中只有1~2個(gè)細(xì)胞。

3.方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個(gè)細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號(hào)筆在皿底把單個(gè)熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺(tái)里用滅過(guò)菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過(guò)這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的是：時(shí)間不能超過(guò)30min，否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時(shí)間長(zhǎng)的方法：拿一個(gè)96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了

培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營(yíng)養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；另外一種方法是對(duì)還沒(méi)有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的培養(yǎng)含有很多生長(zhǎng)因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個(gè)，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時(shí)，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開(kāi)了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過(guò)幾次了效果很好，沒(méi)有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問(wèn)題），你可以試試，只要小心一些就行了。

5.方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來(lái)作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來(lái)作單克隆的，一般的做法都是這樣： 1。3.5cm皿鋪細(xì)胞，長(zhǎng)到大概80％以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。

2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿（1：6）或者兩個(gè)大皿（1：12）。3。再過(guò)一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。

4。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)大量死亡，活下來(lái)的細(xì)胞就形成單克隆。

5，單克隆長(zhǎng)到相對(duì)較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個(gè)，種在兩塊24孔板上。

6。于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結(jié)果確定真陽(yáng)性。

我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到 stable。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過(guò)50％就相對(duì)比較容易了，10％以上的可能最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽(yáng)性也較少。對(duì)于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長(zhǎng)滿了就傳代），好像比較有效。

除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽(yáng)性的基因，我們才用有限稀釋法來(lái)作，要不好像也太麻煩了吧？耗時(shí)也多

單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：

1.單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。

2.單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來(lái)后死亡的現(xiàn)象。

3.篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。

4.過(guò)一段時(shí)間再篩選時(shí)，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫(xiě)，此外，加藥后對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。5.穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再此篩選（需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過(guò)還是可以篩到，不過(guò)需要用合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說(shuō)明外源基因還沒(méi)有丟失。

6.有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長(zhǎng)差不多滿后，每孔消化下來(lái)大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來(lái)有陽(yáng)性的孔就保留下來(lái)，陰性的丟掉。

單克隆化后鑒定：

1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子,或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下。

2.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。

第三篇：一個(gè)人成功與否

一個(gè)人成功與否，關(guān)鍵在于他的心態(tài)。心態(tài)好了，會(huì)使人用積極的狀態(tài)去面對(duì)各種事情；心態(tài)不好，就會(huì)使人消極萎靡，萬(wàn)事不成。所以說(shuō)，心態(tài)會(huì)主宰人的成敗。

若想成功，就要有一個(gè)陽(yáng)光的心態(tài)。這就需要在日常生活中不斷地讓自己變得積極起來(lái)，心靈之中有了陽(yáng)光就會(huì)讓自己對(duì)各種事情都有一個(gè)積極的看法，會(huì)使自己的心靈的陰暗面變得更少。同時(shí)還會(huì)給別人一個(gè)非常好的印象，如果總是看生活中的消極方面，因?yàn)橐稽c(diǎn)小事和別人大吵起來(lái)。那一定是一個(gè)不會(huì)生活的人，真正會(huì)生活的人。一定會(huì)讓自己變得開(kāi)朗、熱情、豁達(dá)、大度，只有這樣才會(huì)成功。

雖然有了陽(yáng)光的心靈，但是在生活中難免會(huì)遇到一些問(wèn)題。這個(gè)時(shí)候一定要說(shuō)“我能行”，不要說(shuō)“我不行”。自己一定要學(xué)會(huì)在消極中找到積極的地方，每個(gè)人都可以做最好的自己，時(shí)刻要記住一句歌

著名的國(guó)學(xué)大師翟鴻燊說(shuō)過(guò)：“積極地人走到哪里，人們都喜歡，消極的人總會(huì)因?yàn)樗菑埬槈牧孙L(fēng)水，所以，不要做氣氛和情緒的污染者?！边@就聯(lián)系到溝通了，一個(gè)消極的人總會(huì)把自己的壞情緒帶給別人，讓人很難接受?？鬃拥膶W(xué)生顏回有兩大優(yōu)點(diǎn)：1。不二過(guò)2。不遷怒。不遷怒往往是一個(gè)人有修養(yǎng)的表現(xiàn)。可能是一個(gè)人惹了你生氣，但不要把氣撒在另一個(gè)人身上，否則，就會(huì)被別人看不起的。自己有不順心的事了，一定要讓自己冷靜下來(lái)，改變一下看問(wèn)題的角度，轉(zhuǎn)移一下自己的不良情緒，然后，尋找解決問(wèn)題的辦法。千萬(wàn)不要像蒼蠅一樣到處傳播負(fù)面的情緒，讓別人去費(fèi)心。一定要從積極的方面考慮，做出一個(gè)讓自己高興，也讓別人高興的事情。

第四篇：成功要素

成功與否

一個(gè)人成功與否，取決于五個(gè)因素：

1、學(xué)會(huì)控制情緒

2、健康的身體

3、良好的人際關(guān)系

4、時(shí)間管理

5、財(cái)務(wù)管理 如果你想成功，一定要學(xué)會(huì)管理好這五個(gè)因素，為什么把情緒放在第一位呢？把健康放在第二位呢？是因?yàn)槿绻阍購(gòu)?qiáng)的身體，如果你情緒不好，就會(huì)影響到 你的身體?，F(xiàn)在一個(gè)人要成功20%靠的是智商，80%靠的是情商，所以你要控制好你的情緒，情緒對(duì)人的影響是非常大的。人與人之間，不要為了一點(diǎn)點(diǎn)小事 情，就暴跳如雷，這樣是不好的。就像動(dòng)作明星史泰龍說(shuō)的：過(guò)去不等于現(xiàn)在，只是暫時(shí)停止成功。任何事情發(fā)生，必有目的，必有助于我！你要經(jīng)常的對(duì)自己說(shuō)，這只是我在風(fēng)雨中磨練性格的一天。

所以在生活中，你要養(yǎng)成什么樣的心態(tài)呢？你要養(yǎng)成“三不”、“三多”(不批評(píng)、不抱怨、不指責(zé)；多鼓勵(lì)、多表?yè)P(yáng)、多贊美）。你就會(huì)成為一個(gè)受社會(huì)大眾歡迎的人。

如果你想讓你的伙伴更加的優(yōu)秀，很簡(jiǎn)單，永遠(yuǎn)的激勵(lì)和贊美他們。即使他們的確有毛病，那應(yīng)該怎么辦呢？這時(shí)是不是應(yīng)該給他們建議？在生活中你會(huì)發(fā)現(xiàn) 有這樣一個(gè)現(xiàn)象：有人給別人建議的時(shí)候，別人能夠接受，但是有人給別人建議的時(shí)候，別人就會(huì)生氣。其實(shí)建議的方式是最重要的，就是“三明治”：贊美、建 議、再贊美！

想一想，你一天贊美了幾個(gè)人，有的人可能以為贊美就是吹捧，就是拍馬屁。贊美和吹捧是有區(qū)別的，贊美有四個(gè)特點(diǎn)：

1、是真誠(chéng)的

2、是發(fā)自內(nèi)心的

3、被大眾所接受的

4、無(wú)私的

如果你帶有很強(qiáng)的目的性去贊美，那就是拍馬屁。當(dāng)你贊美別人時(shí)候，你要大聲的說(shuō)出來(lái)，當(dāng)你想批評(píng)別人的時(shí)候，一定要咬住你的舌頭！

第五篇：電子求職信的成功與否

求職信可以幫助你從其他應(yīng)聘者中脫穎而出，它應(yīng)該簡(jiǎn)明地突出你的相關(guān)實(shí)力。一定要注明你所申請(qǐng)的具體職位，如果必要，還要留下聯(lián)系方法。通過(guò)電子郵件回復(fù)時(shí)，最好遵守招聘廣告的要求，但盡可能增加個(gè)性化。如果可以查到名字和地址，一些應(yīng)聘者喜歡把個(gè)人資料打印出來(lái)寄給用人單位。

嘗試打電話和得到盡可能多的內(nèi)部資料，這個(gè)方法有時(shí)并不奏效，因?yàn)樵S多人事部門(mén)不喜歡擅自提供姓名和另外的資料。最好記住，這些郵箱地址后面是活生生的人。由于兼容性的問(wèn)題，最好把求職信和簡(jiǎn)歷寫(xiě)在郵件內(nèi)，而不要做成附件，招聘者可能無(wú)法打開(kāi)你的附件，如果打開(kāi)了，也許不會(huì)再是你精心設(shè)計(jì)的式樣?，旣?納米克(MaryNemmich)和弗蘭德?喬特(FredJandt)認(rèn)為”幾乎我們?cè)L問(wèn)過(guò)的所有簡(jiǎn)歷網(wǎng)站和招聘者，都警告應(yīng)聘者提交簡(jiǎn)歷時(shí)，不要做成電子郵件的附件?！币?yàn)楝F(xiàn)在很多網(wǎng)站害怕那些隨著應(yīng)聘信而來(lái)的病毒，有的網(wǎng)上招聘專家甚至建議某些公司把所有帶有附件的電子郵件全部刪除。所以，在求職信中，你應(yīng)當(dāng)突出的是你要申請(qǐng)的職位和你的資歷，這些是招聘者最為關(guān)心的問(wèn)題了。

嚴(yán)謹(jǐn)一些是非常有必要的，你知道招聘經(jīng)理們?cè)趺丛u(píng)論那些通過(guò)E-mail發(fā)送有錯(cuò)字的簡(jiǎn)歷的人嗎?沒(méi)戲。找工作的規(guī)矩一點(diǎn)也不因?yàn)榘l(fā)送簡(jiǎn)歷方式的更改而變得更為寬松了。正確地說(shuō)，是比原來(lái)更嚴(yán)格了。

也有人問(wèn)過(guò)，我想申請(qǐng)這個(gè)公司的兩個(gè)職位該怎么辦?這要取決于你發(fā)送簡(jiǎn)歷的站的數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的功能了，有一些軟件能自動(dòng)過(guò)濾掉第二封信件，以免造成冗余;在另一種情況下，一些軟件可能會(huì)根據(jù)你的個(gè)人技能分類而把你的簡(jiǎn)歷轉(zhuǎn)給合適的人。這都很難說(shuō)。所以在這樣的簡(jiǎn)歷上針對(duì)不同的職位進(jìn)行修改實(shí)際上不算一個(gè)好主意。我們的建議是：在這種情況下，不妨針對(duì)申請(qǐng)職位的不同做兩份格式迥異的簡(jiǎn)歷，分別申請(qǐng)不同的職位。各大公司的簡(jiǎn)歷篩選機(jī)制都各不相同，這是一個(gè)很值得研究的問(wèn)題。

很多在國(guó)際范圍找工作的人都有一種很強(qiáng)的失落感，他們往往制作一份比較通用的簡(jiǎn)歷，然后給每個(gè)收簡(jiǎn)歷的人發(fā)送一份，在這種情況下他們不可能充分了解每一個(gè)招聘者的情況，也不可能根據(jù)申請(qǐng)職位的不同而對(duì)簡(jiǎn)歷進(jìn)行修改，這些簡(jiǎn)歷往往就是泥牛入海無(wú)消息了。這種求職戰(zhàn)略基本上是失敗的，對(duì)于國(guó)際化的求職者尤甚。除非你通過(guò)各種途徑或渠道確切地知道你具備招聘單位急需的某種特定的技術(shù)知識(shí)或?qū)I(yè)技能，否則就不要這樣去求職。