第一篇：小鼠尾靜脈注射心得

小鼠尾靜脈注射心得

對血管的選擇

1.小鼠尾部有三條靜脈，左右兩邊各一條而且比較淺，容易穿刺；中間一條較深不容易找到，建議盡量不要選擇。另外穿刺選擇尾部中下1/3-1/2處比較好，因為此處皮膚較薄，可以用75%的酒精反復(fù)擦拭穿刺部位血管，使其充盈，并使皮膚的角質(zhì)層軟化，便于穿刺?；蛘咴谧⑸渲?，小鼠尾巴用溫水泡大約2min,（水溫大約50℃），這樣才能使血管充分舒張。注射前用干棉球擦干，從下往上扎。這樣的好處是萬一一次扎不進，還可以繼續(xù)使用此血管。

2.針的選擇：書上說使用的是1ml的注射器，有人在實驗中用的是頭皮針，后接1ml注射器，因為頭皮針針頭更小，對血管的損傷更小，適合連續(xù)多次給藥，其次使用頭皮針穿刺后，我們可以通過回血來判斷穿刺是否成功。（4號半1ml 注射器已經(jīng)足夠且容易進針。

3.注射手法：左手食指和中指上下夾住你所選擇血管的靠近身體的一邊，無名指和小指墊起一塊紗布或者紙巾（建立一個穿刺的平面的作用），拇指壓住所選血管的尾尖端，上下夾住血管的距離應(yīng)以不影響右手持針上下移動為宜。（否則容易人為建立穿刺的角度，而使右手持穿刺針穿刺過深，導(dǎo)致穿刺失敗。）右手持穿刺針，針斜面向上，針與皮膚稍成一角度（10℃左右），進針后要將針頭稍向上挑，然后將針向里送一點。如果在血管里，則無阻力，并且能看見針。若針看得很清晰，則扎到了皮下，若針看不清，則針扎深了?？吹交匮砻鞒晒?，還可以回抽，見到回血后表明穿刺已進入血管，可以給藥。

4.穿刺結(jié)束后，用紗布壓住穿刺部位反折尾部進行止血。良好并徹底的止血對于血管可以起到很好的保護作用，這對于需要天天穿刺給藥是非常有用的。（一般小鼠需要按壓時間很長，否則易引起出血。）

5.用細針頭皮下進針（我用的是4號）從遠端打起，后面的皮薄一點，較容易打成功（個人看法），打成功時進針會很順暢，注藥沒有阻力，一般不會自己回血，若不成功再往近端打，但一般一條血管打過三次還不成功的話最好先暫停，因為刺激后血管會收縮，很難打，歇一會兒換另一邊打。還有一點，信心很重要！有了信心才能找到感覺。

1.將小鼠固定好,將尾巴拉直，繃緊，這是成功的第一步。

小鼠性情較溫順，一般不會咬人，比較容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴將其放在鼠籠蓋或其它粗糙表面上，在小鼠向前掙扎爬行時，用左手拇指和食指捏住其雙耳及頸部皮膚，將小鼠置于左手掌心、無名指和小指夾其背部皮膚和尾部，即可將小鼠完全固定。在一些特殊的實驗中，如進行尾靜脈注射時，可使用特殊的固定裝置進行固定,如尾靜脈注射架或粗的玻璃試管。如要進行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作,如進行解剖實驗則必須先行無痛處死后再進行。

或者用這個方法：1 小鼠要固定好，自制一個籠子，前面通氣，中間最好有一個擋板，讓小鼠不能后退，筒子后面開一個口，尾巴從這里出來，這樣固定牢靠；

2、注射前尾巴用稍熱的水浸泡幾分鐘，有利于注射；

3、先遠后盡，不要一開始就從尾根部，那樣失敗了不好辦；

4、進血管后注意保持穩(wěn)定，針尖很容易刺穿血管的。至于能否穿進，個人手感如何，全靠自己啦。多練習(xí)，一定很快掌握的，不難，絕對不難！我練習(xí)10余只小鼠就比較熟練了

2.用酒精棉球擦拭尾巴,使血管擴張;或者用熱水或者熱毛巾焐熱，使靜脈擴張；選用適當(dāng)?shù)尼橆^，越細越好；在尾部較靠近上段的地方注射，這里血管比較大。用酒精或熱水擦拭，擦拭的時候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見兩根紅色靜脈。

3.用左手的食指,中指,無名指及大拇指將小鼠尾巴固定,;手法：握住1ml注射器前面0.1ml處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處 按此手形進針；看針尖前面那個斜面有3/4（關(guān)鍵），如果血管充盈則進1/2，進入，停，上挑針頭，進針；左右輕擺動，如可動，可注射。原則是：把你第一次打進的手形，完全固定下來，每次都重復(fù)。

4.注射:注射時左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進針部位，一般選擇距尾尖1/4或1/3處進針，此處皮膚較薄，血管清晰，進針容易。進針時針頭與桌面平行，針尖稍稍朝下，從中指及無名指與拇指接觸處稍上方進針，一旦進入，須將針頭稍稍上挑進入，針頭沿血管進入，肉眼可關(guān)察到針頭前進。如果針頭在血管中前進，可明顯地感覺到針行通暢，毫無阻力。若針頭不在血管中，手感針行有阻力，有一種堵的感覺。進針時不要太深，針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進針，針扎入時有落空感，推液時無阻力則說明成功了！如針頭處出現(xiàn)皮丘則說明在皮下，推出重來。進針處最好在尾巴的1/3-1/2處，甚至可以更下一點。這樣一次失敗了還可以往上再來，不要馬上在最高處打，因為你們要打這么多天。要為以后作準(zhǔn)備。用熱水、酒精、紅外都可以擴張血管?？梢砸暻闆r而用。總而言之，最重要的是“熟能生巧”。你最好先練習(xí)一下或請高手相助。不然到了最后幾天，真的很難打的。

2。注射：針進入后，切記手不可發(fā)抖，因為血管壁非常薄，容易扎穿。推藥時，要緩?fù)啤Ｈ暨M針成功，推藥順暢，無阻力；若推藥時感覺有阻力，說明針頭不在血管中，須及時拔出，重新進針。一般選用4號或4號半針頭。最好用打疫苗的2毫升一次性注射器。尾靜脈注射并不難，主要是一種感覺。若用上十只鼠練手，你必會找到感覺。心要靜，手要穩(wěn)，要有耐心。我研一的時候尾靜脈注射讓我頭疼萬分，越急越打不進去。后來靜下心來，邊注射邊找感覺，很快就熟練了。

祝你找到感覺

5.通過看有無回血來測試針是否在靜脈內(nèi);

6.注射.

第二篇：小鼠尾靜脈注射的心得體會

小鼠尾靜脈注射的心得體會

IV比IP困難許多，我練習(xí)了非常久了之后，才抓到竅門。由于當(dāng)時沒有一個人能指導(dǎo)我，所以我的IV技術(shù)可說是完全自己摸索出來的。當(dāng)我遇到困難時，找了許多課本、網(wǎng)絡(luò)，可是讀了卻做不出來，果然theory跟practical之間還是有差距的。一般書本所形容的IV很簡潔，但實際情況要復(fù)雜許多，因此不先訓(xùn)練，是一定打不好靜脈針的。

照例，打針之前，先量體重、準(zhǔn)備要打的液體、做好稀釋、load好進針筒里面。準(zhǔn)備好完這些后，就開始要抓老鼠了。

但打IV不能靠普通的restraint方法，因為打靜脈要很固定的，不能有絲毫動搖。因此需要一個restrainer，就是一個小小的塑膠東東，來困住老鼠，但它的尾巴可以掉出來。你就抓住它的尾巴，然后往尾巴上的靜脈打針。

這個restrainer一定要把老鼠牢牢地關(guān)在里面，一點都不能動才可以。這時就要盡量把老鼠壓在里面，壓成一團也沒問題，只要不要弄到它骨折，或者呼吸困難就可以了。

一般老鼠雖然喜歡關(guān)在一個圓圓的筒子里，但因為IV需要的是絕對的動彈不得，所以它會被關(guān)壓到蠻不舒服的。而且老鼠不喜歡別人去碰它的尾巴的，所以打尾巴針對它們來說是相當(dāng)痛的。如果不牢牢困住，就算有一點點的位置，它也會掙扎的，它一掙扎，你就打不到了。

為什么那么困難呢？就是因為老鼠尾巴的靜脈其實不大，很小而已，只要稍微移動，很容易就打錯地方了。

打靜脈的針頭我一般用30G，是比26G更加細的針頭。我把步驟簡化如下：

1)把針尖向下，即bevel up，這樣比較容易刺進去，位置也能很精準(zhǔn)

2)從尾巴的最后面開始試，不要一開始就刺比較靠近身體的部位，因為如果弄錯了，還可以一直往上繼續(xù)試，但如果一刺就刺靠近身體的，就沒辦法再上了 3)老鼠尾巴有靜脈的地方會泛有紅色的，就對準(zhǔn)紅色的線條

4)尾巴要抓緊，不要有絲毫動搖，有時候老鼠會掙扎，就要大力一點抓尾巴 5)刺進去時，盡量把針擺得跟尾巴越平行越好，因為稍微有一點角度就打不進去了(平行的話針就會在血管里面，如果有角度可能會刺過血管到血管下面的組織去)6)可以盡量刺深一點，只要是平行就好，刺得夠深的話整支針可以掛在那里不會掉下來的

7)往后拉一拉plunger，如果看到血，位置就對了！

8)位置對的話，保持針的不動，然后注射，注射的時候會覺得很順暢，而且可以親眼看到紅色的血管慢慢被你所注射的液體所flushed，所以紅色就會慢慢變成白色

9)最后把針拉出來，針口的位置會流一點血(代表真的是血管嘛)，然后用一塊棉花按按扎針的部位就可以了

那錯誤又會怎樣發(fā)生咧？舉例如下：

1)明明是看到自己刺到紅色的線條了，可是往后拉的時候沒看到血，只是感覺真空壓力，這時就可以肯定刺錯位置了，刺到尾巴的其他組織上，要拉出來再找一個地方刺，一般不要再刺回同樣一個位置

2)開始注射后發(fā)現(xiàn)很難注射，plunger遇到很大的阻力似的，其實這也是打錯了，不在血管里面就會這樣，這時你就會看到你打針的部位周圍開始泛白，但這個泛白跟血管里面泛白不同，這個泛白就圍繞在你打針的部位，而且尾巴的那個部分會開始腫脹。如果你強迫注射完進去，就發(fā)覺尾巴那里變大了，因為你所注射的液體都集中在這個部分的組織里，沒有進去血管

3)有時候一開始時注射時沒問題，似乎注射進了血管，可是注射到一半突然感覺阻力來了，感覺不在血管里面了，這可能是因為你的針移位了，或者老鼠的尾巴動了

4)如果注射錯誤，泛白了的尾巴部位就再也看不到血管了，因此才要從越下面開始嘗試越好，因為你刺錯后還可以往上在找找看別的位置刺，如果一開始就刺在很上面的位置而且刺錯了，要從下面再注射是很困難的，因為上面已經(jīng)充斥著腫脹的組織，要成功更加困難了

5)另外有一些時候，刺的時候發(fā)覺有血流出來，以為在對位置了，可是開始注射時就注射不進去，這可能跟針的角度有關(guān)系，角度不對就不容易進去，反而會注射到外面去

怎樣可以幫助注射呢？除了要一個很好的restrainer之外，還有一個重要的步驟，就是要給尾巴加溫。因為加溫之后靜脈會放大，放大了之后就比較容易注射。一般我的做法是注射之前拿一盞很熱的燈，照老鼠的尾巴大概5分鐘左右，才開始注射。這個辦法很有用的，如果沒有加溫，效果差別很大。

還有一個TIPS，就是不要擦酒精。酒精有點涼，擦在已經(jīng)加溫后的尾巴上面會馬上給尾巴降溫。我每次擦了酒精之后都打得很困難的，所以還是不擦酒精比較實際。

如果萬事順利，打靜脈針也可以很快的。最好是做好好事前準(zhǔn)備，如果可以第一次注射就成功就是最好了。第一次如果不成功，之后就要更加小心仔細了，不然最后可能落得老鼠的整條尾巴都被刺得白白了，已經(jīng)沒有新的位置可以嘗試了---然后你的實驗做不成功羅！

如果你折磨了老鼠很久才成功的話，老鼠放出來之后會很agitated，情緒會受到一點影響。但是如果做得干凈利落，老鼠不會覺得怎樣的。好啦，就是這樣啦，說是容易，做啊，可真的要許多練習(xí)咧！

第三篇：靜脈注射簡介

靜脈注射簡介

靜脈注射發(fā)生藥效的時間最快，劑量準(zhǔn)確，并可隨時控制速度，也可隨時停止正在注射的藥液，對有刺激性的藥物可以采用這種給藥方法，也可以用于靜脈營養(yǎng)治療，如果注入脫水劑可以降低顱內(nèi)壓力。但必須在正規(guī)醫(yī)療機構(gòu)有醫(yī)療急救保障條件的情況下接受注射，方能確保醫(yī)療安全。

溫馨提示

1、在輸液過程中，請服從醫(yī)務(wù)人員的安排，不要隨意變動座位，不可自行調(diào)節(jié)滴速。

2、在輸液時，如感覺不適，請及時告知護士。

3、輸液拔針后，請按壓5分鐘（但不要揉）

4、注射做“皮試”的藥物，需觀察二十分鐘方可離開。

5、輸液前應(yīng)適當(dāng)進食，避免空腹輸液。

6、貴重物品請妥善保管，以免丟失。

靜脈輸液告知事項

1、為了減少輸液時可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，護士離開后，請您不要擅自調(diào)快液體的滴速。根據(jù)權(quán)威醫(yī)籍《臨床醫(yī)學(xué)護理》載明：輸液不良反應(yīng)與控制輸液速度有密切的關(guān)系，“成年人靜脈輸液速度為每分鐘40—60滴（一般靜滴250毫升藥液需要耗時1小時），對老年、體弱或有心肺疾病的患者，或輸入高滲鹽水、含鉀藥液、升壓藥等，輸液速度宜慢”。因此，敬請各位病友：為了您的身體健康和醫(yī)療安全，請不要自行調(diào)快輸液速度。謝謝合作！特殊藥物輸液速度要求，醫(yī)生會在處方中寫明醫(yī)囑。

2、每瓶大輸液滴注完畢時，對瓶內(nèi)殘留的部份（藥液平面在瓶頸高度時），不宜要求全部輸完（因為殘留液內(nèi)有穿刺瓶塞的微粒、瓶內(nèi)壁在產(chǎn)生消毒過程中的崩脫微粒、藥物配制時產(chǎn)生的極小顆粒，倒置沉淀后單位容積中濃度較高），所以應(yīng)廢棄不用，以保障輸液安全。

3、某些抗菌素靜滴時可能會有一定程度的消化道癥狀刺激副作用，請輸液時適當(dāng)進食，避免空腹輸液。

4、在輸液或使用（頭孢類）藥物的當(dāng)天，請您切記：“禁忌飲酒”，以免造成過敏反應(yīng)。

第四篇：苯酚-氯仿法從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

從小鼠尾巴中抽提基因組DNA

一、試劑與材料

⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0)100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)10mg/ml(溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用時，終濃度達到100ug/ml

⑶ RNaseA RNaseA溶液配制

將RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸鈉（pH5.2）中，使終濃度為10mg／ml，加熱到 100℃，15min。室溫下緩慢冷卻，用0.1體積的1M的Tris-Cl調(diào)整pH至7.4后，小管分裝保存在-20℃。使用時，終濃度為100ug/ml.⑷ Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(體積比)3M 醋酸鈉（pH5.2）；

無水乙醇； 70%乙醇；

無菌ddH2O.⑸ 手術(shù)剪，1.5mlEP管.二、方法

⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(約20-30mg)，立即放入細胞凍存管并投入液氮中（防止基因組DNA降解）。

⑵ 從液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混勻。

⑶ 在熱孵育器中，55℃過夜。（剛開始可每隔30min搖晃一次）

后續(xù)操作可在冰上進行---⑷ 取出EP管，加入等體積Tris平衡苯酚，用力搖晃3min；12000g，離心10分鐘。

⑸ 輕輕吸取上清至一新的1.5mlEP管中（寧可少吸，也不要吸到下層的苯酚或沉淀物）。

⑹ 向上清中加入等體積苯酚/氯仿，用力搖晃2分鐘；12000g，離心2分鐘。⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10體積的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無水乙醇，搖勻。

⑻ 12000g，離心1分鐘，盡可能吸除上層乙醇。

⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力搖勻。（此步為了去除殘留的SDS和苯酚）

⑽ 12000g，離心1分鐘，去除乙醇，再重復(fù)⑼、⑽一次（為了盡可能把DNA清洗干凈）。

⑾ 將EP管倒置在吸水紙上，以吸干乙醇。

⑿ 用65℃預(yù)熱的無菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。⒀ 分光光度計檢測純度、濃度。

DNA提取的注意事項

1、裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應(yīng)注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時應(yīng)注意防護。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時,不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內(nèi)切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA，不能攪動基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時，要用專用的粗口吸頭，普通吸頭可能會切斷DNA或造成DNA缺口。

12、基因組應(yīng)4度保存，如-20度保存可能導(dǎo)致DNA斷裂。

13、在準(zhǔn)備實驗的過程中，應(yīng)將DNA樣品放在碎冰上。

14、用Tris緩沖液溶解DNA。

15、加緩沖液后，為了加速DNA溶解，可以輕輕晃動或輕彈試管。

16、加入緩沖液后，置于4度過夜，也可以溶解DNA

17、將DNA溶液65度溫育10分鐘，可以滅活DNase。

18、在抽提過程中如果水相和有機層的界面不太清楚，說明其中蛋白質(zhì)含量較高，可增加酚/氯仿抽提的次數(shù)或適當(dāng)延長離心的時間。

19、酚抽提時如果上清液太粘稠，無法進行水相轉(zhuǎn)移時，可加入適量TES稀釋后再抽提。

基因組DNA提取方法

制備基因組DNA是進行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。主要是CTAB方法，其他的方法還有1物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2化學(xué)方式：異硫氰酸胍法,堿裂解法3生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等

試驗步驟：

1、貼壁細胞用胰酶消化，離心收集。

2、細胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集。試驗步驟2再重新作一邊。

3、加入5mlDNA提取緩沖液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混勻。

4、加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100ug/ml,混勻，50℃水浴3h，5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的（酚，氯仿，異戊醇）混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相

6、用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm,離心10min。棄上清。

8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。

外周血DNA提取技術(shù)

分離外周血白細胞提取方法： 試驗步驟：

1、取人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。

2、小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中。

3、在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。4、2500rpm離心10min，棄上清。

5、加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。6、3000rpm離心10min，棄上清。

7、倒置離心管，去掉殘液。

8、得白細胞，－80?C凍存。試驗要求： 血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h，4℃放置不超過5h，以防白細胞自溶。

氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA： 試驗試劑： Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加滅菌去離子水至1000ml，高壓滅菌。

ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g；最后加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。

提取緩沖液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌

試驗步驟：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min。

3、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細胞），混勻置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。

6、取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無水乙醇（預(yù)冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。NaI提取法提取外周血白細胞基因組： 實驗步驟：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm離心12min。

2、棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。

3、混勻后加6MNaI溶液200ul，搖勻20s。

4、加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。

5、取上層液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應(yīng)體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼eppendorf管壁。

6、棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動），以15000rpm離心12min。

7、棄乙醇，敞開eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

常用的外周血白細胞基因提取方法： 試驗原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

試驗步驟：

1、將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復(fù)一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉淀，37℃水浴溫育1h。

2、將上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應(yīng)不時上下轉(zhuǎn)動幾次，混勻反應(yīng)液。

3、反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉(zhuǎn)動混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)一次。

4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復(fù)一次。室溫揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

真核細胞DNA的制備

一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實驗。

根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個原則：

1、防止和抑制DNase對DNA的降解。

2、盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。試劑準(zhǔn)備：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris飽和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、無水乙醇、75%乙醇 試驗步驟： 材料處理：

1、新鮮或冰凍組織處理：

1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2)將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混勻。4)60°C水浴1-3hr。

2、培養(yǎng)細胞處理：

1)將培養(yǎng)細胞懸浮后，用TBS洗滌一次。2)離心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍體積的裂解緩沖液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提?。?/p>

1、加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2、離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3、加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。

5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min，棄上清液。

9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過夜。

植物組織中DNA的提取

試驗原理：

脫氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經(jīng)過2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的預(yù)冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來。

植物DNA的SDS提取法： 試驗試劑：

1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。

6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9、1mol／LHCl。10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液［濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實驗步驟：

1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2、將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以4000rpm離心5min。

3、離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。

4、將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液［提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5、再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6、用滴管吸95％的預(yù)冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最終濃度為1×SSC。

8、重復(fù)第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。

9、加入已處理的Rnase溶液，使其最后的作用濃度為50～70μg/ml，并在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10、加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。

11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法： 試驗步驟：

1、稱取新鮮葉片2-3g，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2、將粉末轉(zhuǎn)移到加有7ml經(jīng)預(yù)熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中，迅速混勻后置于65℃水浴中，溫育30min。

3、取出離心管,冷卻至室溫，加入氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻，室溫下2300轉(zhuǎn)離心20min。

4、將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ml離心管中，加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻，2300rpm離心20min。

5、轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ml離心管中，加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000rpm離心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃預(yù)冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml離心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、離心機甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超凈工作臺上吹干。

9、將風(fēng)干的DNA直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μlTE溶液中于-20℃保存。

細菌DNA的提取方法

針對一些不易于提取的細菌的方法: 試驗試劑：

抽提緩沖液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇 70%乙醇 試驗步驟：

1、抽提緩沖液65℃預(yù)熱。

2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，以12,000rpm，離心10min。

4、取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，以12,000rpm，離心10min。

5、重復(fù)再作一次步驟4。

6、加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，離心10min。

8、棄上清，以70％乙醇條洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。較為常用的細菌DNA提取方法： 實驗步驟：

1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

2、取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法： 第一種方法： 試驗步驟：

1、取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振蕩混勻。

3、加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，離心5min。

5、上清再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

6、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀,混勻,靜置約30min。

7、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下處理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

10、取上清，加入1/10倍體積的3MNaAc,2.5倍體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二種方法： 試驗步驟：

1、真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）。

5、取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置約30min。

6、用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干，重懸于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃處理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，離心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200ulTE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

石蠟包埋DNA提取試驗方法

試驗原理：

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而業(yè)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)，是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，進入含SDS和高濃度蛋白酶K（１mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分了生物學(xué)實驗。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進。首先通過組織切片和二甲苯和脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，從而提DNA質(zhì)量，適于做Sorthern印跡雜交分析。

試驗試劑：

配方：3mol/lNacl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，用HCL調(diào)PH值至7。0 石蠟消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l檸檬酸鈉，1%SDS，PH7.0。試驗步驟：

1、取蠟塊切片15-20張（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，離心3min，傾去二甲苯。重復(fù)3-4次，觀察管壁是否光滑。如果仍有蠟質(zhì)殘存，需繼續(xù)脫蠟。

2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室溫下放置30min，以10000rpm離心3min，去上清；再依次分別加入95%；75%；50%的乙醇重復(fù)上面的步驟。

3、消化：以1×SSC500μL加入SSC洗滌沉淀，以12000rpm離心3min。棄去上清夜，干燥沉淀。加入石蠟消化液400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃消化120h，第四天，補加PK10μl。

4、消化后的液體很清亮，肉眼可見的組織較少。將其轉(zhuǎn)入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以滅活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷卻。以10000rpm，離心5min。

5、取上清加等量的酚-氯仿，輕顛倒混勻呈乳白色。低溫下以14000rpm，離心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重復(fù)上面的步驟。

6、取上清加入預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇及1/10的乙酸鈉（PH5.2），顛倒混勻。置于-20℃，30min。低溫下以14000rpm，離心10min，去上清。

7、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌2次，（顛倒eppendorf管數(shù)次）以14000rpm，離心5min，自然干燥沉淀。

8、加TE20μl，（含RNA酶），4℃下過夜。注意事項：

1、取材時應(yīng)避免出血壞死的組織，盡可能選用新鮮的標(biāo)本。

2、消化時應(yīng)不時震搖離心管，使酶與組織充分接觸。

3、福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，勻漿的效果往往不理想，可將組織切成10um的薄片進行消化。

4、消化不完全，可采用高濃度蛋白酶K及延長消化時間。附：elz氏DNA提取方法的主要步驟：

提取液的制備：500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS 500μg/ml蛋白酶ＫpH8.0

1、切除多余石錯，暴露組織。將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱重。

2、溶于TE9提取液(組織<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混懸2－3min，于48℃放置24h。

3、再次混懸組織，加入蛋白酶Ｋ至終濃度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。

4、用等體積酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍體積乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9000rpm離心１h。

5、沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

適用于PCR研究的快速提取法： 試驗步驟：

1、田間剪取植株新鮮葉片5－10mg（約2cm長）左右，新鮮葉片放于15ml離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號貼上相應(yīng)的標(biāo)簽。

2、用剪刀將葉片組織剪細（約0.5cm長）放在點穴式研板中。加入400μlDNA提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細，直到液體變成深綠色即可。

3、加400μlDNA提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號）。

4、加400μl氯仿，混合均勻后，2400轉(zhuǎn)離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的15ml離心管（貼上相應(yīng)的編號）。

5、加800μl無水乙醇，混勻，2400轉(zhuǎn)離心3min。棄上清。70%乙醇沖洗，風(fēng)干。用50μlTE緩沖液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。

Chelex-100法提取DNA： 試驗原理：

Chelex-100是一種化學(xué)螯合樹脂，由苯乙烯、二乙烯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親合力和螯合作用。在低離子強度、堿性及煮沸條件下，可以使細胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，DNA游離。Chelex-100特別適用于微量生物樣本的處理，方法簡便快速，提取過程始終在同一管中進行，不用轉(zhuǎn)移，可減少DNA的損失，操作步驟簡化，減少了污染的機會。

以血液為例實驗步驟：

1、取血液1-3?l，置1.5ml離心管中，加滅菌雙蒸水1ml，振蕩混勻，室溫30min，或置冰箱-20℃5min。2、10000r/min離心5min，棄上清，反復(fù)2-3次。

3、于沉淀中加入200?l懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴過夜。

4、振蕩5-10秒，置100℃5-10min，取出振蕩溶液5-10s。5、10000r/min5min，上清液即可作為PCR反應(yīng)的DNA模板。注意事項：

1、Chelex-100處理模板僅適用于PCR反應(yīng)，處理液不宜長期保存，如果保存的時間稍長，可將上清液轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆谩Ｒ话阍谝恢軆?nèi)使用，如果保存時間過長則會影響PCR擴增結(jié)果。

2、在處理模板的各個步驟中，振蕩要充分。

3、煮沸的溫度、時間要充分，否則將影響擴增。

4、使用前要混勻離心，取上清液作為模板，如果PCR反應(yīng)體系中含有Chelex-100，Mg2+會被螯合，降低酶活性，使PCR擴增失敗。

硅珠法提取DNA： 試驗原理： 在高濃度的硫氰酸胍存在的條件下，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附，當(dāng)沒有硫氰酸胍存在時，DNA又可從二氧化硅中釋放出來。硫氰酸胍是一種高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)及一些不溶的物質(zhì)除去。吸附后的漂洗過程則可將溶液中的PCR抑制物洗去。

試驗試劑：

1、吸附劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.8ml0.5mol/LEDTA，0.5mlTritonX-100。

2、漂洗劑：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

3、硅珠懸浮液：0.06gSilica溶于1ml滅菌超純水。

4、TES：1ml1mol/LTris-HClpH8.0，2ml5mol/LNaCl，2ml0.5mol/LpH8.0EDTA，95ml滅菌超純水。

試驗步驟：

1、取1.5ml離心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混勻，煮沸5min。

2、振蕩混勻，加入300-600?l吸附液，混勻。

3、加入20-40?l硅珠懸浮液，振蕩混勻，置室溫15min，振蕩5s，10000r/min離心2min。

4、除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分懸浮沉淀物，10000r/min離心1min。

5、去上清液，重復(fù)漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min5min。

6、去乙醇，置56℃ 10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋渦混合30s，56℃保溫10min。7、10000r/min離心10min，上清液可直接用于PCR反應(yīng)。固相吸附法提取DNA： 試驗原理：

硫氰酸胍具有溶解細胞和滅活核酸酶的性質(zhì)，利用當(dāng)硫氰酸胍存在時硅藻顆粒能特異性吸附DNA，而當(dāng)去除硫氰酸胍時，DNA又能從硅藻上釋放出來的特性，來提取樣本中的DNA。該方法尤其適用于臨床標(biāo)本的DNA提取。

試驗試劑：

1、裂解液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4，2.2ml0.2mmol/LEDTApH8.0，0.3mlTritonX-100。

2、洗滌液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4。試驗步驟：

1、取100?l樣品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振蕩混合，10000r/min離心1min，去上清。

2、加1ml洗滌液，懸浮沉淀洗滌，10000r/min離心1min，再重復(fù)一次。加1ml70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃ 10min。

3、加60?lTE緩沖液混勻，56℃ 10min，10000r/min離心5min，上清液備用.DNA含量的檢測和純化

DNA含量的檢測：

一種方法是通過凝膠電泳的方法檢測DNA的含量：取2-5?lDNA溶解液與0.4?l6×載樣緩沖液混合，用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5?g/ml)檢測。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，這種熒光強度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比，通過比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強度，對樣品中的DNA進行定量。（詳見凝膠電泳）另一方法是分光光度法，組成DNA的堿基，具有一定的吸收紫外線的特性，其最大吸收值在波長250-270之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外線的特性沒有改變，核酸的最大吸收波長為260nm，利用DNA的這個物理特性來測定DNA的濃度。

分光光度法的具體方法是：

1、取兩只清潔的比色杯，各加入2ml0.1mol/LNaOH校正零點。

2、以其中的一只比色杯作為空白對照，在另一只比色杯中加入4?lDNA溶液，再加入0.1mol/LNaOH至2ml混勻。

3、測定波長為260nm時的OD值，再將波長調(diào)至280nm測其OD值。

4、根據(jù)OD260=1時，雙鏈的DNA濃度為50?g/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40?g/ml，按計算公式：樣品DNA濃度(?g/ml)=OD260×40?g/ml×稀釋倍數(shù)，計算樣品的DNA濃度。

DNA純化：

首先利用瓊膠電泳將不同分子量的DNA片段分開,將某一特定分子量區(qū)域的瓊膠切下,利用DNAextractionkit將DNA從瓊膠中溶出并濃縮。（可參考質(zhì)粒DNA的純化）實驗材料： 1、6Xgel-loadingde:15%Ficoll400,0.25%bromophenolblue,0.25%xlenecanol紫外光箱

2、DFBuffer

3、WashBuffer

4、ElutionBuffer:10mMTris-HCl(pH8.5)

5、DFColumn 6、2mlCollectionTube 實驗步驟：

1、將欲分離之DNA混合物以0.7%瓊膠電泳分離。

2、電泳后,將瓊膠置於紫外光箱上觀察,把含有欲純化之DNA片段的瓊膠部位切下。

3、將步驟B的瓊膠以藍色微量吸管盡可能戳碎。

4、加入500mlDFbuffer,55oC作用10分鐘,每2-3分鐘搖晃數(shù)次,直至瓊膠完全溶解。

5、將步驟D瓊膠溶液全部吸入DFColumn,并套上CollectionTube(收集過濾液)。6、8000rpm離心1分鐘,將過濾液倒掉。加入500mlWashBuffer,8000rpm離心1分鐘,過濾液倒掉。14000rpm離心2分鐘。

7、將DFColumn轉(zhuǎn)移至上另一乾凈的微量離心管.加入15mlElutionBuffer,室溫靜置2分鐘。8、14000rpm離心2分鐘,微量離心管內(nèi)之液體即為純化的DNA片段。

9、取0.5ml純化的DNA加入4.5mlDDW及1ml6xDNAloadingde,跑0.7%瓊膠電泳,與marker比較,估計DNA的濃度。

第五篇：小鼠品系介紹

Swiss、KM、ICR、CD-1小鼠品系來源與優(yōu)缺點

1.品系名稱由來

（1）Swiss：1926年美國Rockfeller研究所的Clara Lynch博士從瑞士（Switzerland）Centre Anticancereux Romand的de Coulon實驗室引入非近交白化小鼠，培育成Swiss小鼠。

（2）KM：1944年3月17日衛(wèi)生部北京生物制品研究所湯飛凡教授從印度Hoffkine研究所引進Swiss小鼠，飼養(yǎng)在中國昆明中央防疫處。由于該小鼠起初引入地是昆明，故稱之為昆明小鼠，這就是昆明小鼠品系名稱的由來。

（3）ICR：1948年，美國費城癌癥研究所（Institute of Cancer Research, ICR）Hauschka以多產(chǎn)為目標(biāo)，用Rockfeller研究所培育出的Swiss小鼠群進行選育，培育出Ha/ICR，以后由美國腫瘤研究協(xié)會分送各國飼養(yǎng)實驗，各國稱為ICR小鼠。中國科學(xué)院遺傳研究所在1973年從日本國立腫瘤研究所引進，1979中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分院動物中心引進，1978年北京檢定所引進，1983年上海計劃生育研究所從瑞士蘇黎世毒理學(xué)研究所引進。

（4）CD-1：1948年Edward Mirand博士將費城癌癥研究所培育的Ha/ICR引入Roswell Park Memorial Institute，命名為HaM/ICR。1959年美國Charles River Lab引入該品系并于同年進行了剖腹產(chǎn)，并命名CD-1（ICR），并注冊CD-1?商標(biāo)。

2.優(yōu)缺點

（1）KM：優(yōu)點是抗病力和適應(yīng)力很強，繁殖率和成活率高。KM小鼠基因庫大，基因雜合率高，在中國昆明小鼠作為實驗動物用于生物醫(yī)學(xué)研究已有半個多世紀(jì)之久，一直是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交群（封閉群）小鼠，被廣泛應(yīng)用藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究，以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定，藥典中甚至將KM小鼠作為某些檢測項目的指定用動物。目前國內(nèi)已從KM小鼠遠交群中先后培育出不少近交系小鼠：C-1，615，TA2，AMMS/1等。缺點：國內(nèi)各地昆明小鼠遺傳背景不很一致，不同地飼養(yǎng)的昆明小鼠封閉群的生長發(fā)育與繁殖性能存在較大差異。

（2）ICR：優(yōu)點是除了抗病力和適應(yīng)力強，繁殖率和成活率高之外，從全球范圍來看，ICR小鼠的使用更為普遍，其背景資料也更為豐富，而且發(fā)表文章時動

物品系這一考核指標(biāo)更容易被接受。缺點：與KM小鼠相同，不同地域飼養(yǎng)的封閉群差別也較大。

（3）CD-1：是ICR小鼠的升級替代品系。因為Charles River Lab已經(jīng)注意到了ICR小鼠的缺點，為了減少CD-1小鼠因不同地域飼養(yǎng)而引起的不同封閉群之間在生長發(fā)育與繁殖性能上的差異，Charles River將世界各地繁殖的CD-1種群按計劃定期輪換，形成了具有國際遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的CD-1 IGS（International genetic standard）小鼠。這也是CD-1小鼠特有的優(yōu)勢，1999年北京維通利華公司從Charles River引入CD-1核心群，成為中國大陸唯一授權(quán)使用其注冊商標(biāo)權(quán)的單位。